PKCε-Nampt通路調(diào)控線粒體自噬防治腦缺血損傷的研究進(jìn)展

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細(xì)胞經(jīng)自噬途徑選擇性降解損傷或多余的線粒體的過(guò)程即為線粒體自噬。線粒體自噬對(duì)于線粒體的質(zhì)量控制至關(guān)重要，并且參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程，其中包括缺血性腦損傷，即腦缺血。越來(lái)越多的證據(jù)表明線粒體自噬在不同的腦缺血病理過(guò)程中扮演了重要的角色。近年來(lái)，線粒體自噬被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用，且調(diào)控線粒體自噬對(duì)細(xì)胞存活非常重要。因此，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究關(guān)注線粒體自噬的過(guò)程和其具體調(diào)控機(jī)制。本研究旨在對(duì)蛋白激酶Cε(PKCε)-煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)通路的作用機(jī)制進(jìn)行闡述，并總結(jié)其調(diào)控線粒體自噬的可能機(jī)制和在腦缺血中扮演的角色，為腦缺血的線粒體靶向治療提供新思路。

1 蛋白激酶C(PKC)和PKCε-Nampt通路

PKC是一種參與信號(hào)傳導(dǎo)通路非常重要的蛋白激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，PKC通過(guò)使底物蛋白分子內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)功能[1-2]。細(xì)胞內(nèi)大部分生命過(guò)程，如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡、各種應(yīng)激事件及神經(jīng)活動(dòng)的發(fā)生都涉及蛋白激酶磷酸化，并且蛋白激酶磷酸化也是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中及其重要的環(huán)節(jié)。PKC不僅能使底物蛋白分子內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，而且還能夠影響基因的表達(dá)調(diào)節(jié)和細(xì)胞增生等，其在機(jī)體作用很廣泛[2]。經(jīng)典型的PKC(cPKC)包括α、βⅠ、βⅡ、γ四種亞型；新奇型的PKC(nPKC)包括δ、θ、η、ε四種亞型；非經(jīng)典型的PKC(aPKC)包括λ、ξ。其中PKCε在腦組織內(nèi)含量十分豐富。PKC可影響神經(jīng)細(xì)胞的生存，影響神經(jīng)功能恢復(fù)，與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死密切相關(guān)。因此PKC與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

目前國(guó)外對(duì)于PKCε-Nampt通路通過(guò)調(diào)控線粒體自噬從而保護(hù)缺血缺氧的神經(jīng)元的研究正處于上升期[3]。其保護(hù)神經(jīng)元的具體機(jī)制及其在預(yù)防和治療腦缺血疾病方面的潛在臨床價(jià)值仍有待研究[4]。PKCε是PKC家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶同種型，能夠賦予大規(guī)模線粒體保護(hù)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)，同時(shí)是其他致命性缺血性損傷的重要信號(hào)通路。Nampt是參與氧化型輔酶Ⅰ(NAD)生產(chǎn)的酶，能夠維持線粒體功能和賦予缺血性應(yīng)激后的神經(jīng)保護(hù)。腦缺血后的異常能量代謝誘導(dǎo)線粒體損傷，例如減少呼吸、自由基產(chǎn)生和促凋亡因子的釋放[1，5]。保持線粒體健康的機(jī)制，增強(qiáng)缺血性損傷后的神經(jīng)元活力，是產(chǎn)生缺血耐受的關(guān)鍵[6]。

2 PKCε與AMP激活蛋白激酶(AMPK)的調(diào)控關(guān)系

PKCε活性影響許多與缺血性神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的線粒體過(guò)程的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)PKCε可以調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(MAPK)途徑和AMPK，表明PKCε能夠，調(diào)節(jié)線粒體生理學(xué)的酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)[7-9]，PKCε還可以直接調(diào)節(jié)線粒體功能。在海馬的研究表明PKC可易位到線粒體，從而磷酸化線粒體K+-ATP通道[10-11]，增加線粒體呼吸，減少線粒體氧化應(yīng)激活性氧(ROS)產(chǎn)生，并抑制細(xì)胞色素C釋放[12-13]共同發(fā)揮作用保護(hù)線粒體對(duì)缺血的損傷。

Morris-Blanco等[5]在體外實(shí)驗(yàn)中將神經(jīng)元膠質(zhì)皮層培養(yǎng)物暴露在ΨεRACK(Tat-結(jié)合的PKCε活化劑)(100 nmol/L)1 h后，分析神經(jīng)元膠質(zhì)皮層培養(yǎng)物中的全細(xì)胞裂解物，其顯示磷酸化AMPKThr172(AMPK的活化形式)水平顯著增加，同時(shí)還評(píng)估了乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化(是AMPK的直接下游靶標(biāo))。ACCSer79磷酸化在ψεRACK處理后也顯著增加。同時(shí)為了確定PKCε是否在體內(nèi)激活A(yù)MPK，Morris-Blanco 等[5]在將大鼠經(jīng)ψεRACK腹膜內(nèi)注射(0.5 mg / kg)后1 h從皮質(zhì)中收集全細(xì)胞裂解物，這也導(dǎo)致磷酸化-AMPKThr172和磷酸-ACCSer79的顯著增加，表明PKCε足以激活A(yù)MPK，PKCε是缺血或白藜蘆醇預(yù)處理期間AMPK激活所需的關(guān)鍵信號(hào)通路。這些研究充分證明AMPK是PKCε調(diào)控的下游。

3 PKCε與AMPK共同參與調(diào)控Nampt，以PKCε為主

Neumann 等[14]研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理在48 h后誘導(dǎo)Nampt水平增加(1.7±0.2)倍，但通過(guò)添加PKCε抑制劑ζV1-2可阻斷該效應(yīng)。同時(shí)在IPC期間暴露于AMPK抑制劑對(duì)線粒體Nampt水平?jīng)]有影響。表明PKCε是缺血預(yù)處理后增加線粒體Nampt必不可少的因素。AMPK通過(guò)其與p53的相互作用促進(jìn)凋亡性細(xì)胞死亡；AMPK還通過(guò)調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子和配體調(diào)節(jié)劑[PGC1alpha、FOXO3a和sirtuin 1(SIRT1)]誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生，增強(qiáng)線粒體活性氧清除劑的表達(dá)，并增加線粒體呼吸，從而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[15]。AMPK可以增強(qiáng)Nampt的表達(dá)，Nampt是NAD主要生物合成途徑中的限速酶。盡管AMPK參與增強(qiáng)Nampt mRNA表達(dá)[16-17]，但目前還沒(méi)有研究調(diào)查了AMPK調(diào)節(jié)Nampt的線粒體特異性庫(kù)。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈在維持線粒體膜電位和產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)中所必需輔酶[1，18]。在腦中，氧化應(yīng)激或缺血事件后NAD的減少引起線粒體去極化，減少呼吸，產(chǎn)生凋亡信號(hào)和神經(jīng)元死亡。相反，研究證實(shí)細(xì)胞NAD的增加能預(yù)防腦缺血后線粒體功能障礙和神經(jīng)變性[5，10]。缺血事件期間NAD的減少引起DNA損傷，能量耗竭并導(dǎo)致神經(jīng)變性。Nampt過(guò)表達(dá)產(chǎn)生NAD來(lái)預(yù)防局部缺血后的線粒體功能障礙和神經(jīng)元死亡[10，19]。在氧化應(yīng)激后特異性增強(qiáng)線粒體定位的NAD能夠保持線粒體膜電位，增強(qiáng)呼吸并防止凋亡誘導(dǎo)因子在大腦中的釋放。Nampt對(duì)神經(jīng)退行性損傷的保護(hù)作用最近已成為激烈研究的焦點(diǎn)。PKCε調(diào)節(jié)線粒體Nampt增加與NAD + / NADH比率的增加相關(guān)。NAD + / NADH比率的增加與NAD+依賴SIRT的活性相關(guān)。PKCε也可通過(guò)增加線粒體中的NAD + / NADH比率來(lái)調(diào)節(jié)線粒體SIRT活性。在缺血期間，PARP(DNA修復(fù)酶)的過(guò)度激活介導(dǎo)NAD +消耗和凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。PKCε介導(dǎo)的線粒體NAD+可用性的增加可能有助于穩(wěn)定線粒體PARP的活性，維持NAD+庫(kù)，從而維持線粒體DNA完整性和預(yù)防細(xì)胞死亡[6，20]。在缺血或氧化應(yīng)激期間通過(guò)線粒體NAD的保存可以維持電子傳輸鏈的活性，增強(qiáng)SIRT活性和防止PARP介導(dǎo)的NAD+耗盡來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)元活力。

4 PKCε-Nampt通路通過(guò)調(diào)控線粒體脫硫酶基因提供缺血性神經(jīng)保護(hù)

PKC家族已經(jīng)連接到sirtuins[21-22]，是NAD +依賴性賴氨酸脫酰酶，與缺血和線粒體神經(jīng)保護(hù)相關(guān)。sirtuins的主要調(diào)節(jié)劑是Nampt，其通過(guò)增加NAD +水平增強(qiáng)sirtuin活性[23-24]。Nampt在預(yù)防腦缺血后的神經(jīng)變性中至關(guān)重要，因?yàn)檫z傳研究顯示當(dāng)Nampt被敲除時(shí)損傷加重[25-26]。Nampt過(guò)表達(dá)激活SIRT減弱缺血性損傷，表明Nampt-沉默調(diào)節(jié)蛋白通路可能對(duì)缺血性保護(hù)具有重要作用。哺乳動(dòng)物沉默調(diào)節(jié)蛋白家族由七種同工型(SIRT1-7)組成，它們的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，亞細(xì)胞定位和酶活性不同。雖然研究證實(shí)核或細(xì)胞質(zhì)sirtuins與腦中的缺血保護(hù)相關(guān)[27-29]，sirtuins在IPC保護(hù)免受缺血性應(yīng)激的能力中起著不可或缺的作用，但是研究重點(diǎn)一直在于SIRT1的核或細(xì)胞質(zhì)活性。SIRT3-5是公認(rèn)的線粒體沉默調(diào)節(jié)蛋白，其各自顯示獨(dú)特的酶翻譯后修飾[30]。例如，SIRT3是賴氨酸脫乙酰酶，SIRT4是賴氨酸ADP-核糖基酶，SIRT5是賴氨酸脫琥珀酰酶[2，19，31]。SIRT3和SIRT5定位于線粒體，分別被鑒定為線粒體賴氨酸脫乙?；唾嚢彼崦撶牾；闹饕{(diào)節(jié)劑[24，31]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，約三分之一的線粒體蛋白含有賴氨酸乙酰基或賴氨酸琥珀?；稽c(diǎn)[24，31]，這表明SIRT3和SIRT5可能對(duì)線粒體功能具有廣泛的影響。

Nampt是sirtuin活性的有效活化劑，因?yàn)閟irtuin需要NAD +作為輔因子以驅(qū)動(dòng)其活性。Morris-Blanco等[5]研究表明腦缺血后48 h，SIRT5脫琥珀酰酶活性在大鼠神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的線粒體中增加。通過(guò)在腦缺血期間暴露大鼠神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞于PKCε抑制劑εV1-2至線粒體，SIRT5活性的這種增加被消除。與SIRT5活性結(jié)果相反，ΨεRACK處理對(duì)線粒體SIRT3脫乙酰酶活性沒(méi)有影響。在ΨεRACK處理后48 h沒(méi)有觀察到線粒體蛋白或SIRT3的賴氨酸乙?；癄顟B(tài)的總體變化。這些數(shù)據(jù)表明PKCε和線粒體Nampt是SIRT5去琥珀酰酶活性的主要調(diào)節(jié)劑；PKCε-Nampt通路增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)和皮質(zhì)線粒體SIRT5表達(dá)；SIRT5參與調(diào)節(jié)線粒體生物能量代謝、呼吸和腦缺血的神經(jīng)保護(hù)。

SIRT5阻止細(xì)胞死亡的確切機(jī)制目前還不清楚，但可能包括多種機(jī)制。例如，在腦缺血后，BAX轉(zhuǎn)移到線粒體，其中它結(jié)合到ATP/ADP轉(zhuǎn)位酶以形成涉及觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放和caspase介導(dǎo)的凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔[21]。 PKCε通過(guò)防止凋亡信號(hào)傳導(dǎo)[9]為缺血后的心肌細(xì)胞提供保護(hù)。SIRT5與心肌細(xì)胞培養(yǎng)中的Bcl-xL(一種結(jié)合BAX的蛋白)的水平相互作用并調(diào)節(jié)其水平。此外，在氧化應(yīng)激后，SIRT5的敲低增加胱天蛋白酶活性。SIRT5也可以與細(xì)胞色素C[32-33]相互作用，但是這種相互作用的功能結(jié)果目前還不清楚。該證據(jù)表明，在PKCε活化后，SIRT5介導(dǎo)的針對(duì)細(xì)胞死亡的保護(hù)可以包括參與細(xì)胞凋亡的幾種蛋白質(zhì)和酶。

5 PKCε-AMPK-Nampt-SIRT5協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的線粒體功能

PKCε在對(duì)腦缺血的保護(hù)中具有確定的作用。在缺血損傷之前，期間或之后使用PKCε的藥理學(xué)活化劑能有效防止皮質(zhì)和海馬中的神經(jīng)變性[32]。 PKCε已被證明可對(duì)由腦缺血引發(fā)的缺血缺氧[9，33]提供強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)；同時(shí)PKCε對(duì)于由白藜蘆醇和轉(zhuǎn)錄激活劑AMPK提供的缺血性神經(jīng)保護(hù)也可能是必需的。研究發(fā)現(xiàn)PKCε在腦缺血期間能夠預(yù)防興奮性毒性信號(hào)傳導(dǎo)和減少微血管血流量[34]。 PKCε進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)以及直接磷酸化線粒體蛋白質(zhì)來(lái)提供線粒體保護(hù)，以增加ATP產(chǎn)生，降低活性氧簇產(chǎn)生，維持線粒體膜電位和減少線粒體腫脹[8-9，35]。PKCε激活A(yù)MPK，增加Nampt線粒體池，從而增強(qiáng)NAD +水平，提供線粒體保護(hù)，減輕腦組織缺血損傷。Nampt是PKCε介導(dǎo)的缺血保護(hù)和調(diào)節(jié)SIRT5活性所必需的。這種保護(hù)途徑最可能發(fā)生在神經(jīng)元中，因?yàn)镹ampt主要在神經(jīng)元中表達(dá)[25-26]，SIRT5在神經(jīng)元中相對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞更強(qiáng)烈地表達(dá)[29，36]。

目前的研究表明，PKCε-Nampt通路選擇性增強(qiáng)SIRT5活性，而SIRT3活性保持不變。因此，PKCε可能提高SIRT5蛋白的穩(wěn)定性。然而使用Nampt抑制劑在分離的線粒體上的實(shí)驗(yàn)揭示，SIRT5去琥珀酰酶活性的增加與增加的NAD+可用性直接相關(guān)?；谶@一證據(jù)，Nampt和NAD +的產(chǎn)生似乎是SIRT5活性增加的驅(qū)動(dòng)因素。SIRT5和Nampt水平在PKCε激活后的線粒體中增加的事實(shí)表明，這些酶可以充分協(xié)同調(diào)節(jié)對(duì)線粒體功能的影響。

6 總結(jié)與展望

PKCε在缺血誘導(dǎo)后被激活，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活因子AMPK的活性，進(jìn)而上調(diào)Nampt的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體Nampt增加，Nampt水平上調(diào)增強(qiáng)NAD +水平，進(jìn)而誘導(dǎo)并增加SIRT5的賴氨酸脫琥珀酰酶活性。SIRT5去琥珀酸化線粒體中的多個(gè)未知靶點(diǎn)，導(dǎo)致線粒體復(fù)合體活性的維持和對(duì)缺血損傷的保護(hù)。

盡管PKCε已經(jīng)在腦缺血中廣泛研究，但是在實(shí)驗(yàn)性卒中模型中PKCε的作用機(jī)制研究缺乏。Bright等[37]研究顯示線粒體選擇性PKCε激活劑在缺血再灌注損傷后24 h改善神經(jīng)學(xué)評(píng)分，這表明線粒體PKCε激活可為腦缺血提供更好的治療作用。腦缺血后的許多異常細(xì)胞聚集在線粒體上，導(dǎo)致能量代謝失敗，氧化應(yīng)激和凋亡信號(hào)傳導(dǎo)[5]。在已往的研究中，PKCε-Nampt通路已被確定為參與缺血性損傷后穩(wěn)定線粒體的主要參與者[33，38-39]。作為線粒體琥珀酰化的廣泛調(diào)節(jié)劑，SIRT5可以通過(guò)調(diào)節(jié)許多線粒體蛋白和酶以提供保護(hù)[40-41]，繼而保持線粒體生物能量運(yùn)轉(zhuǎn)和保護(hù)大腦中的代謝應(yīng)激和缺血性損傷。目前，抗缺血性腦卒中的中藥有效成分，多對(duì)線粒體自噬具有一定調(diào)控作用。進(jìn)一步研究SIRT5如何被優(yōu)先激活及其介導(dǎo)線粒體保護(hù)的作用機(jī)制以及PKCε-Nampt通路調(diào)控線粒體自噬保護(hù)缺血神經(jīng)元的其他可能機(jī)制，可以幫助確定中藥調(diào)控PKCε-Nampt通路、線粒體自噬的靶點(diǎn)，為腦缺血的線粒體靶向治療提供新思路。