葡萄酒功能性微生物選育研究進展

王雪薇，杜展成，武運*，薛潔*

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830052；2. 新疆芳香莊園酒業(yè)股份有限公司，新疆和碩 830000；3. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

隨著國內(nèi)葡萄酒市場的標準化以及人們經(jīng)濟條件的日益增長，消費者對于葡萄酒的質(zhì)量要求也越來越高，此時，當消費者選擇葡萄酒時，其品質(zhì)尤為重要。然而，目前國內(nèi)葡萄酒與進口葡萄酒在各方面都存在著差距，其中最明顯的就是葡萄酒的口味及風格。進口葡萄酒品種多樣，口味獨特且風格各異，而中國葡萄酒則風味基本一致，出現(xiàn)產(chǎn)品同質(zhì)化的現(xiàn)象[1-2]。由于釀酒葡萄的種植期較長，從原料上改變同質(zhì)化現(xiàn)象耗時且昂貴，而借鑒傳統(tǒng)葡萄酒強國的經(jīng)驗[3-4]，采用具有典型的、個性化的釀酒微生物是改善葡萄酒風味快速有效的一種方法。因此，選育具有功能性的葡萄酒優(yōu)良釀酒微生物對中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有深遠的意義。

1 葡萄酒與微生物

人類對于葡萄酒釀造技術(shù)的掌握，早于對葡萄酒微生物了解。微生物是葡萄酒釀造的基礎(chǔ)，微生物作用于葡萄汁，將葡萄汁轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸丫啤＿@個過程涉及到很多微生物，一類如酵母菌之類的有益菌，它們將糖轉(zhuǎn)化為酒精，使葡萄酒產(chǎn)生香氣，如我們通常說的釀造香，對葡萄酒的口感有重要作用；比如乳酸菌，它們在紅葡萄酒和少數(shù)白葡萄酒的二次發(fā)酵中起到主要作用，可以降低葡萄酒酸度，改善口感，提高穩(wěn)定性。另一類是葡萄酒釀造有害菌，比如非釀酒酵母，我們一般都認為其為葡萄酒釀造過程中的有害菌，這些雜菌的生長會影響葡萄酒風味，甚至引起葡萄酒品質(zhì)發(fā)生改變[5]。與葡萄酒釀造有關(guān)的微生物可以分為：酵母、細菌和霉菌。

1.1 葡萄酒中酵母菌的組成和功能

酵母菌是葡萄酒釀造的靈魂。葡萄酒釀造過程中，酵母將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳，并在發(fā)酵過程中生成醇、酯、醛類代謝產(chǎn)物。這個過程決定了葡萄酒的風味、口感。

目前，有關(guān)于葡萄酒的酵母菌有24屬120種，幾乎包括酵母菌的主要屬種[6]。其中主要有酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）、德克酵母屬（Dekkera）、有孢漢生酵母屬（Hanseniaspora）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、畢赤酵母屬（Pichia）、類裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、結(jié)合酵母屬（Zygosaccharomyces）等十個屬的酵母[7]。其中酵母屬酵母是葡萄酒釀造過程中必不可少的微生物，酵母菌的生長可以抑制葡萄表面霉菌的繁殖，酵母菌在葡萄酒釀造過程中可以將糖轉(zhuǎn)化成酒精、二氧化碳，是葡萄汁轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸丫频闹饕⑸?；葡萄酒釀造過程中，有400多種揮發(fā)性香氣物質(zhì)是酵母的發(fā)酵而產(chǎn)生[8]。

在葡萄酒釀造行業(yè)中，酵母菌分為釀酒酵母和非釀酒酵母。王鳳梅等[9]指出，在釀造過程中雖然非釀酒酵母會產(chǎn)生影響葡萄酒品質(zhì)的異味物質(zhì)，但是某些非釀酒酵母卻可以增加葡萄酒的香氣及風味。

1.2 葡萄酒中細菌的組成和功能

與葡萄酒釀造相關(guān)細菌有以下三類：乳酸菌（Lactic acid bacteria）、醋酸菌（Acetic acid bacteria）、芽孢桿菌（Bacillus）。乳酸菌主要有乳桿菌屬（Latobacillus）、酒球菌屬（Oenococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）[10]。在細菌當中酒酒球菌用來進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，簡稱MLF），MLF又被稱為二次發(fā)酵，是在酒酒球菌的作用下，將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的過程，該過程釋放二氧化碳。MLF降低葡萄酒酸度，增加葡萄酒的微生物穩(wěn)定性，影響葡萄酒的感官品質(zhì)，酸的降低能夠增加葡萄酒的順滑感，大多數(shù)乳酸菌能產(chǎn)生葡糖苷酶，葡糖苷酶的足量能夠促進葡萄酒品種香的產(chǎn)生[11-12]。

乳酸菌的研究廣泛且深入，研究的熱點集中于乳酸菌對葡萄酒的影響。對葡萄酒而言大多數(shù)細菌都是有害菌，能夠?qū)频钠焚|(zhì)造成不同程度的影響，比如醋酸菌會將葡萄酒中的乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，對葡萄酒的品質(zhì)及風味造成破壞[13-14]。因此在釀造過程中，應(yīng)盡量避免細菌的感染，并監(jiān)測葡萄酒釀造過程中整體的微生物狀態(tài)。

1.3 葡萄酒中霉菌的組成和功能

霉菌是一種絲狀真菌，在潮濕的環(huán)境中，霉菌會侵染葡萄果實，造成減產(chǎn)，影響其品質(zhì)。陳釀橡木桶的內(nèi)外表面、瓶裝葡萄酒的軟木塞處也容易感染霉菌。大多數(shù)的霉菌會影響葡萄酒的外觀及口感，并且極易對葡萄酒的風味造成不良影響，部分霉菌的次級代謝產(chǎn)物會對人體造成極大傷害，比如致癌性[15]。然而霉菌也不能一概而論，源自匈牙利的貴腐酒就是由被稱為“貴族霉”灰霉菌釀造而成[16]。目前，除了貴腐葡萄酒外霉菌在葡萄酒釀造方面鮮有研究，所以霉菌在葡萄酒釀造行業(yè)中還具有很大的研究空間。

2 葡萄酒功能性微生物的研究進展

葡萄酒功能性微生物是生產(chǎn)具有獨特風味及口感葡萄酒的最基本和最重要條件，在特色葡萄酒釀造過程中有著不可或缺的地位[17]，沒有優(yōu)質(zhì)的釀酒微生物就不可能獲得優(yōu)質(zhì)的葡萄酒[18]。因此，葡萄酒功能性微生物的選擇對于建立特色的葡萄酒品牌、樹立產(chǎn)業(yè)旗幟具有重要意義。

目前，由于葡萄酒市場競爭力和消費者對葡萄酒質(zhì)量需求的增長，越來越多的學(xué)者開始了特色酵母菌的選育與應(yīng)用，主要方法包括傳統(tǒng)菌種篩選、有性雜交育種、誘變育種以及分子生物學(xué)技術(shù)等[19]。歐洲地區(qū)通常使用自然發(fā)酵工藝，他們主張當?shù)仄咸丫平湍纲Y源的作用；美國則強調(diào)高效生產(chǎn)和打造優(yōu)質(zhì)葡萄酒，他們經(jīng)常使用原生質(zhì)體融合技術(shù)、有性雜交技術(shù)，甚至轉(zhuǎn)基因技術(shù)來培育釀酒微生物以用于生產(chǎn)；與歐美的葡萄酒大國相比，我國葡萄酒因為產(chǎn)業(yè)起步較晚，與之還存在很大的差距[20]。目前，我國采用紫外誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)成功的選育出了一些特色釀酒酵母菌，如耐高溫低溫、耐受二氧化硫、調(diào)節(jié)pH等[21]。

2.1 改善葡萄酒品質(zhì)的微生物

2.1.1 產(chǎn)香酵母

產(chǎn)香酵母在葡萄酒釀造中具有非常重要的作用，有400多種揮發(fā)性香氣物質(zhì)是酵母的發(fā)酵而產(chǎn)生。目前，在葡萄酒生產(chǎn)當中運用比較廣泛的產(chǎn)香酵母一般為產(chǎn)酯酵母，如生香活性干酵母。肖陽等[22]從葡萄酒泥中分離得到一株產(chǎn)香能力強的酵母菌株P(guān)ichia sp.，該菌種發(fā)酵產(chǎn)香為酯香，其中產(chǎn)生的香氣以乙酸乙酯為主。雷靜等[23]通過對‘無核白’葡萄自然發(fā)酵液分離初篩，篩選出1株可以有效提高葡萄酒的總酯含量的酵母菌株W4，該酵母發(fā)酵葡萄酒產(chǎn)酯量可達到7.335 g/L。商敬敏等[24]從葡萄園土壤中分離出了118株酵母菌，其中5株酵母菌發(fā)酵的葡萄酒樣品中乳酸乙酯含量明顯高于其他酒樣，果香味優(yōu)雅濃郁。Perez-coello等[25]從葡萄園種植土壤、果實、葉片中篩選出174株酵母菌，其中13株酵母菌具有良好的產(chǎn)香性狀，能夠提高葡萄酒中的草藥香氣。很多研究報道了葡萄酒的發(fā)酵香，在葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的葡萄漿果中原本不存在的香氣物質(zhì)，但特定產(chǎn)香酵母的選育極少，我國葡萄酒生產(chǎn)中廣泛使用活性干酵母，產(chǎn)品的同質(zhì)化現(xiàn)象十分嚴重，篩選特色產(chǎn)香酵母對于我國發(fā)展特色葡萄酒具有重要意義。

2.1.2 調(diào)節(jié)葡萄酒有機酸的微生物

葡萄酒中的有機酸是葡萄酒的主要化學(xué)成分之一，有機酸影響著葡萄酒的類型和品質(zhì)優(yōu)劣，適量的有機酸可以賦予葡萄酒醇厚、清爽等口感特征要素[26]。葡萄中的有機酸主要包括酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，其中酒石酸和蘋果酸占總酸的90%以上[27]。酸度對于葡萄酒口感具有極大的影響作用，酸度過高會使葡萄酒酸澀感較重，口味粗糙；酸度過低則會使葡萄酒顏色黯淡無光，口感單調(diào)。由于地域差異，我國不同葡萄產(chǎn)區(qū)其釀酒葡萄之間存在極大差異，東北地區(qū)（東北三?。┢咸言系乃岫韧^高，所以在葡萄酒釀造過程中常常面臨降酸問題，而西北地區(qū)（新疆產(chǎn)區(qū)）由于該地區(qū)晝夜溫差大、降雨量少等氣候特點，該葡萄酒產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄原料含酸量較低。篩選能調(diào)節(jié)葡萄酒中有機酸的菌株，從而形成酒廠或特定地區(qū)的專屬菌株，將改善我國葡萄酒普遍同質(zhì)化的問題并形成更具區(qū)域性特色的葡萄酒。馬文瑞等[28]篩選出1株產(chǎn)酸含量高的釀酒酵母Y6，用于小型葡萄酒發(fā)酵生產(chǎn)試驗中，與市售釀酒酵母71B相比，產(chǎn)酸量提高了1.84 g/L。劉芳[29]選育出1株釀酒特性優(yōu)良的酒酒球菌SD-2a，以商業(yè)菌種作為對照，該菌株對于酒精、低pH值、高濃度SO2具有更為優(yōu)良的耐受性，MLF速率高，降酸能力強。目前國內(nèi)外在葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中主要使用化學(xué)方法調(diào)節(jié)葡萄酒中有機酸，雖然國內(nèi)外對于選育能夠調(diào)節(jié)葡萄酒有機酸的微生物研究較多，其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用尚未報道，將調(diào)節(jié)有機酸微生物利用于大規(guī)模的生產(chǎn)具有良好的前景。

2.1.3 MLF高耐受性微生物

MLF是乳酸菌蘋果酸-乳酸酶的作用下，雙羧基L-蘋果酸轉(zhuǎn)變成單羧基L-乳酸和二氧化碳的過程[30]。MLF過程有利于形成葡萄酒風味的復(fù)雜性，對于釀造高品質(zhì)的葡萄酒非常重要[31]。葡萄酒的MLF過程受各因素的影響，如酒精度、SO2濃度、pH值、溫度等。其中酒精含量是影響MLF的主要因素，酒精濃度的增加會抑制MLF；SO2對MLF有明顯的抑制作用，SO2濃度與抑制作用呈正相關(guān)，不同菌株對SO2的耐受性也有顯著差異；葡萄酒中的pH也是影響MLF的重要因素，一般小于3.8；溫度對于MLF也有著很大的影響，溫度太低會導(dǎo)致葡萄酒無法開始MLF[32-33]。這就要求葡萄酒生產(chǎn)需要高耐受酒精度、SO2濃度、pH值和溫度的菌株。因此，選育出MLF高耐受性菌株，已經(jīng)成為釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的重要因素。段云浩等[33]從自然發(fā)酵葡萄酒中分離的14株乳酸菌，并對其酒精度、SO2濃度、pH值的耐受能力進行了測試，篩選出一株MLF高耐受性菌株。Iorizzo等[34]從自發(fā)進行MLF的南意大利葡萄酒中，分離、篩選出植物乳桿菌M10，該菌株表現(xiàn)出很好的高酒精濃度和低pH值的耐受力，有很好的MLF發(fā)酵表現(xiàn)和β-D-葡萄糖苷酶活性。我國大多數(shù)葡萄酒廠依靠進口直投式活性乳酸菌或自然發(fā)酵的方法。對葡萄酒進行MLF，致使生產(chǎn)成本增加或葡萄酒質(zhì)量很難保證，篩選MLF高耐受性微生物，并將其廣泛用于我國葡萄酒的生產(chǎn)，對于確保葡萄酒MLF過程，保證葡萄酒品質(zhì)，具有重要的意義。

2.2 葡萄酒中降解有害物質(zhì)的微生物

2.2.1 低產(chǎn)氨基甲酸乙酯微生物

酵母代謝過程中精氨酸產(chǎn)生的尿素是葡萄酒酒精發(fā)酵中重要的氨基甲酸乙酯（EC）前體物質(zhì)。研究表明釀酒酵母具有以應(yīng)變特異性代謝精氨酸和尿素分泌的能力。不同酵母菌對降解精氨酸產(chǎn)生尿素的能力不同，在MLF中，乳酸菌代謝對EC的產(chǎn)生有著顯著影響[33]。因此，選育不分泌或分泌尿素量低的酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。付方圓[35]篩選出的酵母菌Y44及植物乳桿菌LB均比商業(yè)酵母產(chǎn)生更低的EC。國外對于能夠降解尿素的微生物，通常采用基因改造的方法，Coulon等[36]根據(jù)氮代謝抑制原理及調(diào)節(jié)機制，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建出EC基因工程菌，Suizu等[37]通過破壞CAR1基因構(gòu)建不產(chǎn)尿素的酵母菌?？傊?，對酵母基因進行改造降解葡萄酒中尿素，對降低酒中EC含量有重大意義，但這些研究仍在小型實驗室階段，未用于大型生產(chǎn)當中。

2.2.2 降解生物胺微生物

葡萄酒中的生物胺來源廣泛，從葡萄原料開始，葡萄酒釀造整個過程微生物代謝都可產(chǎn)生。葡萄漿果本身就含有組胺、酪胺、腐胺等多種生物胺，一些生物胺含量在發(fā)酵過程中降低，可能是因為微生物的降解作用[38]。研究表明，MLF過程之后生物胺含量顯著增加[39-40]。葡萄酒中的生物胺主要來自乳酸菌引發(fā)的蘋乳發(fā)酵，乳酸菌可能是導(dǎo)致生物胺增加的原因，因此，選育降解或低產(chǎn)生物胺的乳酸菌是降低葡萄酒中生物胺的有效措施。李華等[41]對我國自主篩選的22株優(yōu)良酒酒球菌進行了檢測，均不產(chǎn)生腐胺、酪胺、組胺，具有較高的生物胺代謝安全性。王德良等[42]從釀酒葡萄表面篩選得到一株能夠有效降低添加腐胺、組胺和酪胺的植物乳桿菌，該菌株能直接應(yīng)用于葡萄酒的釀造，具有較好MLF高耐受性，蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化率極高，可有效的降低葡萄酒中的生物胺的含量。目前國內(nèi)外對于篩選產(chǎn)生生物胺微生物研究廣泛且深入，但選育能直接降解葡萄酒中生物胺微生物的研究很少。選育降解葡萄酒中生物胺的微生物，逐漸成為相關(guān)微生物研究的熱點問題之一。

2.2.3 降解赭曲霉毒素A微生物

赭曲霉毒素A（OTA）是曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，它對腎臟和肝臟造成損害，還能致癌、致畸形、致突變，對免疫系統(tǒng)造成損害。食品法典委員會（CAC）認為葡萄及葡萄酒中的OTA污染是最嚴重的健康風險之一，僅次于谷類。運用生物方法清除OTA引起了相關(guān)領(lǐng)域廣泛的關(guān)注，許多研究者們開展了相關(guān)的研究。生物法去除OTA有兩種主要形式：一種是使用能夠降解某些產(chǎn)毒微生物的生物酶，從而達到去除毒素的目的；另一種是利用一些微生物吸附OTA以從食品中去除。有研究表明，酒酒球菌和植物乳酸桿菌等細菌以及酵母細胞壁制劑等都可有效降低葡萄酒中的OTA含量[43]。Abrunhosa等[44]選擇76株真菌進行OTA降解能力的評估，其中以曲霉為主的51株菌株能夠降解80%以上的OTA，其中黑曲霉、棒曲霉、赭曲霉、雜色曲霉和溫特曲霉降解能力達95%以上，且黑曲霉和赭曲霉降解OTA得到的化合物不同。目前，利用生物技術(shù)從葡萄酒中去除OTA的研究主要集中在微生物吸附以去除葡萄酒中的OTA，關(guān)于直接降解葡萄酒中OTA的技術(shù)應(yīng)用報道很少。利用微生物降解葡萄酒中的OTA，并將其規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用需要更深入的探索和研究。

3 展望

隨著進口葡萄酒對國產(chǎn)酒沖擊的增大，國內(nèi)葡萄酒市場競爭日益激烈，人們對葡萄酒品質(zhì)需求的提高，葡萄酒的品質(zhì)就顯得尤為重要。采用釀酒微生物對葡萄酒的風味進行改善確是一種快速且有效的方法，單一品質(zhì)的釀酒微生物已經(jīng)不能夠滿足葡萄酒行業(yè)的需求。因此，為了適應(yīng)不同區(qū)域、不同品種、不同風格、不同消費需求的葡萄酒的生產(chǎn)，選育典型性強、個性化突出的功能性釀酒微生物勢在必行。因此，選育具有功能性的葡萄酒優(yōu)良釀酒微生物對我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分深刻的意義。