曲克蘆丁腦蛋白水解物對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞后大鼠神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用

曾靜，王茹，李丹丹，趙弘軼，張微微，黃勇華

卒中是導(dǎo)致人類死亡和致殘的首要原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。針對(duì)卒中的治療，研究人員進(jìn)行了大量的臨床前研究，并取得了很多引人注目的成果，但用于臨床治療時(shí)，大多數(shù)研究的有效性和安全性都是值得懷疑的。近年來(lái)，關(guān)于卒中的研究集中于治療神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU），能夠恢復(fù)NVU的整體功能是國(guó)內(nèi)外專家普遍認(rèn)可的有效治療策略的關(guān)鍵。NVU的概念最早由LO等[2]提出，是一種結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)獨(dú)立的多細(xì)胞復(fù)合體，由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分構(gòu)成[3]，調(diào)節(jié)NVU各組分之間的相互作用，維持微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，從而維持神經(jīng)元正常的功能[4]。

曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液是曲克蘆丁與豬腦提取物制成的復(fù)方制劑，具有抑制紅細(xì)胞和血小板聚集、防止血栓形成、改善微循環(huán)、增加血中氧的含量、促進(jìn)血管生成等作用[5]。曲克蘆丁用于急性腦梗死的治療已有30多年的歷史，但多數(shù)是與其他藥物如依達(dá)拉奉等聯(lián)用協(xié)同治療急性腦梗死[6]，且其作用機(jī)制還不十分清楚。

Longa法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是目前國(guó)內(nèi)外廣泛采用的局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭籟7]，其效果與人類卒中的臨床表現(xiàn)接近。本次實(shí)驗(yàn)采用Longa線栓法制備大鼠局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停ㄟ^(guò)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光、7.0T磁共振成像技術(shù)等方法，評(píng)價(jià)曲克蘆丁腦蛋白水解物對(duì)神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)作用可能的機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 120只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重（250±20）g，購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液（吉林四環(huán)制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H22026572，以下簡(jiǎn)稱“曲克蘆丁”）。兔抗血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗體（sc-14014，SANTA CRUZ，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子），兔抗Occludin多克隆抗體（sc-5562，SANTA CRUZ，緊密連接標(biāo)記分子），小鼠抗基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）單克隆抗體（sc-393859，SANTA CRUZ），兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白[（glial fibrillary acidic protein，GFAP）；ab33922，abcam，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子]，小鼠抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）單克隆抗體（ab49999，abcam），兔抗3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）單克隆抗體（N 0409，SIGMA），兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（GB11002，谷歌生物），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽[（4’，6-diamidine-2-phenyl indole，DAPI）；C0060，Solarbio]，尼氏染色液（C0117，碧云天），硅膠栓線80根（北京西濃科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作 將120只雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)（SHAM）組（n=40）、MCAO組（n=40）以及MCAO+曲克蘆丁治療組（n=40）。參照Longa法制備MCAO動(dòng)物模型，大致步驟如下：10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，將麻醉完全后的大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，沿頸部正中線切開，小心分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在距離頸總動(dòng)脈分叉處約2 mm處剪開一個(gè)小口，從此處將硅膠栓線插入頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈直至大腦中動(dòng)脈開口處。假手術(shù)組：僅分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。

1.3 分組處理 MCAO+曲克蘆丁治療組于術(shù)后立即給予曲克蘆丁3 ml/kg，1次/日腹腔注射3 d，MCAO組和假手術(shù)組均給予等量生理鹽水腹腔注射。所有大鼠均置于適宜的溫度和濕度環(huán)境中，自由飲水，自由取食。

1.4 行為學(xué)檢測(cè) 參照CHEN等[8]的改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified Neurological Severity Score，mNSS），每組取10只大鼠，分別于栓塞后3 d、7 d、14 d進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。mNSS包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡4個(gè)方面內(nèi)容，共18分，得分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5 磁共振成像 栓塞后3 d對(duì)進(jìn)行mNSS評(píng)分的所有大鼠進(jìn)行7.0T高分辨率磁共振掃描（首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室），取T2序列及動(dòng)脈自旋標(biāo)記（arterial spin label，ASL）序列分別反應(yīng)梗死的區(qū)域及血流情況。

1.6 尼氏染色 栓塞后3 d，每組取10只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟依次灌注300 ml生理鹽水及300 ml 4%多聚甲醛溶液，完整取出腦組織，依次放入4%多聚甲醛溶液、20%蔗糖、30%蔗糖中浸泡各6 h，進(jìn)行冰凍切片。取各組相同部位的腦片行尼氏染色，觀察神經(jīng)元的數(shù)量及形態(tài)變化。

1.7 免疫熒光 從上述準(zhǔn)備完畢的腦片中，分別取各組對(duì)應(yīng)部位的腦片進(jìn)行免疫熒光染色，一抗為內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、緊密連接的標(biāo)記物vWF（1∶100）、GFAP（1∶1000）及Occludin（1∶100），二抗為Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（碧云天，1∶500），采用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色結(jié)束后利用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，然后利用Photoshop軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)于處于圖片邊界線上的標(biāo)記物，只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于一團(tuán)熒光標(biāo)記物，按單個(gè)計(jì)數(shù)，然后計(jì)算各組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8 蛋白印跡法 栓塞后3 d，每組各取10只大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速斷頭取出整個(gè)大腦，各組取左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)相同大小的腦組織，置于液氮中保存，待各組取材完畢后或者需要時(shí)進(jìn)行蛋白提取，盡量各組同一批提取，避免操作步驟的微小差異影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后進(jìn)行蛋白電泳，一抗為iNOS（1∶1000）、MMP-9（1∶200）、3-NT（1∶1000）以及內(nèi)參GAPDH（1∶2000），二抗為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔的IgG（Abmart，1∶4000）和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（谷歌生物，1∶4000）。具體步驟不再贅述?？贵w孵育結(jié)束后利用BIO-RAD ChemiDoc XRS+ Software進(jìn)行顯色，然后采用Image J圖像分析軟件對(duì)顯色結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計(jì)算各組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)改變 分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d，每組隨機(jī)取10只大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，結(jié)果顯示，MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組相比，神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低（P3d＜0.05，P7d＜0.01，P14d＜0.01），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1和圖1）。

2.2 磁共振成像 大腦中動(dòng)脈栓塞后栓塞區(qū)域在T2序列上呈高信號(hào)，在ASL序列上血流信號(hào)明顯減低，MCAO+曲克蘆丁治療組較MCAO組在T2序列上未見(jiàn)明顯差異，而在ASL序列上血流信號(hào)明顯增強(qiáng)，血流增加（圖2）。

2.3 曲克蘆丁對(duì)神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用 尼氏染色結(jié)果顯示（圖3），MCAO后，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，大量空泡形成，細(xì)胞排列紊亂，存活神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。而MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組相比，上述改變明顯減輕。免疫熒光染色結(jié)果顯示（圖4），MCAO組vWF及Occludin較假手術(shù)組明顯減少，而GFAP則顯著增多；MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組比較，vWF及Occludin較多，而GFAP減少（P＜0.05）。

2.4 曲克蘆丁的作用機(jī)制 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，MCAO后，iNOS、MMP-9的表達(dá)增加，3-NT產(chǎn)生增多，MCAO+曲克蘆丁治療組與MCAO組相比，iNOS、MMP-9的表達(dá)顯著減少，3-NT產(chǎn)生減少（P＜0.05）（圖5）。

圖1 栓塞后3 d、7 d、14 d各組mNSS結(jié)果比較

表1 曲克蘆丁對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞后mNSS評(píng)分的影響

圖2 栓塞后3 d三組磁共振成像

圖3 栓塞后3 d三組尼氏染色（40×10）

圖4 栓塞后3 d三組內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、緊密連接的標(biāo)記分子的免疫熒光染色

3 討論

缺血性卒中不僅損傷神經(jīng)元，還損傷膠質(zhì)細(xì)胞和微血管，而且這種損傷還可以通過(guò)細(xì)胞之間的相互作用損傷周圍細(xì)胞[9]。卒中后腦細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列病理改變，能量代謝紊亂、興奮性氨基酸活性增強(qiáng)、炎癥刺激、氧化應(yīng)激以及凋亡等[10]。因此，僅針對(duì)一種細(xì)胞類型或局限于維持神經(jīng)元功能的治療，往往不能收到滿意的效果。而更加廣泛的保護(hù)NVU的各細(xì)胞組分，可能成為卒中新的治療策略。

iNOS是一氧化氮合酶的3種亞型之一，在生理?xiàng)l件下很少表達(dá)，而在缺血性卒中等病理?xiàng)l件下卻可以大量表達(dá)[11]，其表達(dá)產(chǎn)物3-NT也顯著增加，而3-NT的大量形成已被證實(shí)參與了腦缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病、腦外傷等多種病理?yè)p傷過(guò)程[12]。MMP-9是一類能水解細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶，具有降解血管基膜、激活細(xì)胞因子等多種生物活性，還參與了血腦屏障的破壞、血管動(dòng)脈粥樣硬化形成、缺血性卒中出血性轉(zhuǎn)化、卒中后恢復(fù)等病理過(guò)程[13]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的細(xì)胞類型，與神經(jīng)元的激活以及突觸傳遞有著密切的聯(lián)系，參與腦內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)[14]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是MMP的主要來(lái)源，在很多疾病如缺血性卒中導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著升高[15]，因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞增多以及MMP-9的表達(dá)增多可以作為神經(jīng)元受損的標(biāo)志之一。

本研究表明，曲克蘆丁可以減少M(fèi)CAO后神經(jīng)元凋亡，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及血腦屏障緊密連接。之前已有研究表明，曲克蘆丁具有抑制血小板聚集、防止血栓形成的作用[5]。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞是NVU的重要組成部分，本研究第一次通過(guò)MCAO模型表明曲克蘆丁對(duì)NVU具有保護(hù)作用。

曲克蘆丁可以減輕MCAO后神經(jīng)功能缺損。本研究通過(guò)對(duì)MCAO后3 d、7 d、14 d大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分表明，曲克蘆丁能顯著減輕MCAO后神經(jīng)功能缺損。

前已述及，腦缺血缺氧損傷后，iNOS、MMP-9大量表達(dá)，3-NT產(chǎn)生增多，本研究也證實(shí)也這個(gè)觀點(diǎn)。曲克蘆丁則可以抑制MCAO后iNOS、MMP-9的表達(dá)，減少3-NT的產(chǎn)生。

總之，本研究證明了曲克蘆丁腦蛋白水解物可能通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)，減少3-NT、超氧化物的產(chǎn)生，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增殖，減少M(fèi)MP-9的產(chǎn)生，從而對(duì)MCAO后NVU具有保護(hù)作用。然而，本研究?jī)H從抑制MMP表達(dá)和減輕氧化應(yīng)激兩方面對(duì)曲克蘆丁作用機(jī)制進(jìn)行了探索，曲克蘆丁的其他作用機(jī)制仍不清楚；此外，本研究?jī)H從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究曲克蘆丁的作用及機(jī)制，尚缺乏大量的臨床實(shí)驗(yàn)，因此，本課題后期將更加深入地探討曲克蘆丁的作用機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的臨床研究。

圖5 栓塞后3 d三組iNOS、MMP-9、3-NT的表達(dá)情況

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