貴陽(yáng)二球懸鈴木白粉病病原鑒定及防治藥劑篩選

黃道貫，李繼業(yè)，彭麗娟

(1.冊(cè)亨縣植保植檢站，貴州 冊(cè)亨 552200；2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

二球懸鈴木(Platanusacerifolia)是一球懸鈴木(PlatanusoccidentalisLinn.)與三球懸鈴木(PlatanusorientalisLinn.)的雜交種，具易移栽，耐干旱，生長(zhǎng)速度快，存活壽命長(zhǎng)，病蟲(chóng)害發(fā)生較少等優(yōu)點(diǎn)[1，2]。因其樹(shù)體高大雄偉，葉片大茂密蔭濃，樹(shù)枝冠擴(kuò)展寬，有很強(qiáng)的適應(yīng)城市環(huán)境生長(zhǎng)的能力，能防止風(fēng)沙、可吸收部分有害氣體達(dá)到凈化清潔空氣的作用，具消減隔離煩雜噪音的功能；夏天能遮避陽(yáng)光對(duì)地面的照射，行人在涼爽的樹(shù)下行走或休息；冬天樹(shù)葉脫落后又不遮太陽(yáng)等優(yōu)點(diǎn)，在世界各地城市廣泛種植，被譽(yù)為“世界行道樹(shù)之王”[3，4]。

近年來(lái)，我國(guó)青島、杭州、南京、武漢等城市的二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病先后大面積發(fā)生[5]。貴州有關(guān)二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病發(fā)生及病原菌鑒定未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。白粉病為害導(dǎo)致二球懸鈴木嫩葉皺縮，葉片表面布滿(mǎn)白色粉狀物，影響樹(shù)木的正常生長(zhǎng)，葉片早落，嚴(yán)重影響城市綠化景觀(guān)。

懸鈴木科(Platanaceae)樹(shù)木白粉病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，歐洲在保加利亞、法國(guó)、德國(guó)[6]、希臘、匈牙利、意大利、葡萄牙、羅馬尼亞、斯洛伐克、西班牙和英國(guó)等國(guó)分布；亞洲在阿塞拜疆、中國(guó)、韓國(guó)[7]、以色列和土耳其等過(guò)分布；非洲在南非分布；北美洲在美國(guó)分布；南美洲在阿根廷、巴西[8]和智利等國(guó)分布；大洋洲在澳大利亞和新西蘭均有分布[9]。

為了解貴陽(yáng)二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病發(fā)生的情況及病原物種類(lèi)，篩選防治二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病效果較好的藥劑。本文對(duì)貴陽(yáng)二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定，并在室內(nèi)篩選抑制二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病菌效果較好的藥劑，為貴陽(yáng)防治二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病提供科學(xué)理論依據(jù)，對(duì)城市行道樹(shù)保護(hù)具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 二球懸鈴木白粉病發(fā)生情況調(diào)查

1.1.1調(diào)查地點(diǎn) 在貴陽(yáng)市選擇云巖區(qū)寶山北路(編號(hào)為1)；南明區(qū)遵義路(貴陽(yáng)火車(chē)站，編號(hào)為2)；觀(guān)山湖區(qū)黔靈山路(編號(hào)為3)；花溪區(qū)貴州民族大學(xué)(編號(hào)為4)、花溪區(qū)黃金大道(編號(hào)為5)、花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)(編號(hào)為6)等6個(gè)地點(diǎn)，進(jìn)行貴陽(yáng)市二球懸鈴木白粉病發(fā)生情況調(diào)查。

1.1.2調(diào)查方法 2015年8月下旬，上述6個(gè)調(diào)查地點(diǎn)道路兩旁的二球懸鈴木，隨機(jī)選5棵樹(shù)，每棵樹(shù)下部葉片隨機(jī)采集50張葉片，每個(gè)調(diào)查地點(diǎn)共計(jì)250張葉片。仔細(xì)觀(guān)察每張葉片的癥狀，根據(jù)懸鈴木白粉病發(fā)病程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行記錄，計(jì)算各調(diào)查地點(diǎn)白粉病發(fā)病率以及病情指數(shù)[11]。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1形態(tài)特征 從二球懸鈴木(P.acerifolia)上采集感染白粉病病葉片帶回實(shí)驗(yàn)室，先觀(guān)察病害癥狀特點(diǎn)，然后制作臨時(shí)玻片在顯微鏡下觀(guān)察白粉病菌形態(tài)特征，拍照保存。

1.2.2rDNA-ITS序列 采集感染白粉病的二球懸鈴木新鮮葉片，用高溫灼燒后冷卻的手術(shù)刀(3號(hào)刀柄，11號(hào)刀片)刮取黃豆粒大小的白粉病菌孢子于無(wú)菌1.5 mL離心管中。采用EZUP柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，NO.B518259)提取白粉菌總DNA，引物為ITS4，ITS5[12]，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟參見(jiàn)彭麗娟等[13]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，結(jié)果經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比較，根據(jù)比較結(jié)果，鑒定白粉菌。

1.3 二球懸鈴木白粉病菌室內(nèi)藥劑篩選

1.3.1供試菌種 于貴州大學(xué)南校區(qū)校園及附近街道的二球懸鈴木(P.acerifolia)上采集新鮮白粉病病葉，用毛筆將病原菌分生孢子刷到無(wú)菌培養(yǎng)皿(ф6 cm)中用無(wú)菌水配制懸浮液備用。

1.3.2供試藥劑及濃度 本實(shí)驗(yàn)選用7種藥劑測(cè)定對(duì)白粉菌分生孢子萌發(fā)抑制作用。供試藥劑名稱(chēng)、劑型、有效成分及生產(chǎn)廠(chǎng)家見(jiàn)表1。用無(wú)菌水稀釋7種藥劑，濃度分別為1、2、4、8和16 μg/mL。不加藥劑的分生孢子懸浮液為對(duì)照。

表1 供試藥劑Tab.1 Fungicides for test

1.3.3分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂載玻片法測(cè)定分生孢子萌發(fā)率[14]，將分生孢子懸液涂片的瓊脂載玻片置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后在顯微鏡下觀(guān)察個(gè)處理分生孢子萌發(fā)情況。記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算分生孢子萌發(fā)率、藥劑對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制率[15]。根據(jù)陳年春[16]的計(jì)算抑菌中量Ec50的方法，使用農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算藥劑對(duì)二球懸鈴木白粉病菌的抑菌中量Ec50。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴陽(yáng)市二球懸鈴木白粉病的發(fā)生

通過(guò)2015年8月對(duì)貴陽(yáng)市二球懸鈴木白粉病發(fā)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，6個(gè)調(diào)查地點(diǎn)中，二球懸鈴木白粉病發(fā)病率、病情指數(shù)最高的是南明區(qū)遵義路(貴陽(yáng)火車(chē)站)，發(fā)病率為36.90%，病情指數(shù)為26.78；其次是云巖區(qū)寶山北路，發(fā)病率為30.10%，病情指數(shù)為20.65；發(fā)病率最低的花溪區(qū)黃金大道，發(fā)病率為4.30%，病情指數(shù)為3.01。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。

圖1 貴陽(yáng)市各調(diào)查地點(diǎn)二球懸鈴木白粉病發(fā)病率(%)及病情指數(shù)Fig.1 The incidence of powdery mildew on P. acerifolia and disease index at different sites in Guiyang City

表2 貴陽(yáng)市二球懸鈴木白粉病發(fā)生病情指數(shù)Tab.2 Disease index of powdery mildew on P. acerifolia in Guiyang City

2.2 二球懸鈴木白粉病癥狀及病原菌鑒定

2.2.1二球懸鈴木白粉病癥狀 通過(guò)在貴陽(yáng)市花溪區(qū)定點(diǎn)觀(guān)察二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病發(fā)生規(guī)律發(fā)現(xiàn)，二球懸鈴木(P.acerifolia)白粉病在每年4月初開(kāi)始發(fā)生，8月達(dá)到發(fā)病盛期；主要為害二球懸鈴木(P.acerifolia)樹(shù)干抽出的嫩梢上的嫩葉，其次為害較老的葉片。為害初期葉片上有白色粉狀物，后逐漸變?yōu)榈S色粉斑。葉片嚴(yán)重時(shí)，葉片皺縮，不能正常展開(kāi)，葉片邊緣特別是掌裂處的葉尖扭曲、嚴(yán)重縱卷，嫩葉甚至出現(xiàn)縱卷，扭曲成團(tuán)等現(xiàn)象。老葉受害程度較輕(圖2)。

2.2.2二球懸鈴木白粉病的病原菌形態(tài) 通過(guò)對(duì)二球懸鈴木白粉病菌的菌絲體、分生孢子、梗分生孢子形態(tài)，分生孢子大小測(cè)定，鑒定二球懸鈴木白粉病菌的無(wú)性型為粉孢屬(Oidium)，主要特征：菌絲體無(wú)色，分生孢子梗直立、棍棒狀、不分枝、基部無(wú)隔縊縮，分生孢子單胞、無(wú)色、單生或串生，橢圓形或圓形[17，18]，分生孢子大小為25.65～53.03(39.79) μm×20.05～33.04(26.04) μm，分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管有時(shí)呈二叉狀分枝(圖3)。

2.2.3rDNA-ITS序列比對(duì) 白粉病菌PCR產(chǎn)物測(cè)序后，登陸NCBI網(wǎng)站，利用BLAST軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離的白粉病菌ITS序列與懸鈴木白粉菌(Erysipheplatani(Howe) U.Braun & S.Takam.)同源性為99%，登錄號(hào)為JX997805[7]。

2.3 室內(nèi)藥劑篩選

2.3.17種藥劑對(duì)二球懸鈴木白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制 采用瓊脂載玻片法測(cè)定7種藥劑在相同藥劑濃度條件下對(duì)二球懸鈴木白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率。7種藥劑在最低濃度16 μg/mL時(shí)，對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制率75%以上的藥劑有80 %硫磺WG、28%咪鮮·己唑醇SC、75%甲硫·乙嘧酚WP、25%三唑酮WP、70%甲基硫菌靈WP等5種；抑制率最高的是80%硫磺WG，為85.31%；抑制率最低的是12.5%腈菌唑ME，為69.23%；7種藥劑對(duì)二球懸鈴木白粉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果從高到低依次為：80%硫磺WG>25%三唑酮WP>28%咪鮮·己唑醇SC>75%甲硫·乙嘧酚WP>70%甲基硫菌靈WP>400 g/L氟硅唑EC>12.5%腈菌唑ME。

a.二球懸鈴木白粉病為害狀；b.二球懸鈴木白粉病葉片正面；c.二球懸鈴木白粉病葉片背面

a，c分生孢子萌發(fā)；b，d，e分生孢子及分生孢子梗。

表3 7種藥劑對(duì)二球懸鈴木白粉病菌孢子的毒力測(cè)定Tab.3 Virulence levels of seven kinds of fungicides to powdery mildew conidia on P. acerifolia

2.3.27種藥劑抑制病菌分生孢子萌發(fā)的EC50結(jié)果 7種藥劑對(duì)抑制二球懸鈴木白粉病菌分生孢子萌發(fā)的EC50及毒力回歸方程見(jiàn)表3。7種藥劑對(duì)二球懸鈴木白粉病菌的EC50都比較低，表明二球懸鈴木白粉病菌分生孢子對(duì)這7種藥劑均很敏感。其中，28%咪鮮·己唑醇SC的敏感性最高(EC50為0.2876 μg/mL)，其次是25%三唑酮WP(EC50為0.3150 μg/mL)，70%甲基硫菌靈WP敏感性最低(EC50為1.4728 μg/mL)。

3 結(jié)論與討論

本研究每個(gè)調(diào)查點(diǎn)的二球懸鈴木(P.acerifolia)自身的樹(shù)齡大小有差異，樹(shù)木長(zhǎng)勢(shì)狀況不一，樹(shù)木枝條被修剪的頻率也不同，以及它們所處環(huán)境有所差異。這些因素造成各調(diào)查地點(diǎn)間白粉病發(fā)病率高低不同。本研究選擇的6個(gè)調(diào)查地點(diǎn)，3個(gè)是城市街道，分別是云巖區(qū)寶山北路(編號(hào)為1)，南明區(qū)遵義路(貴陽(yáng)火車(chē)站，編號(hào)為2)，觀(guān)山湖區(qū)黔靈山路(編號(hào)為3)；3個(gè)是校園或風(fēng)景區(qū)，分別是花溪區(qū)貴州民族大學(xué)(編號(hào)為4)、花溪區(qū)黃金大道(編號(hào)為5)、花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)(編號(hào)為6)。南明區(qū)火車(chē)站、云巖區(qū)寶山北路和觀(guān)山湖區(qū)黔靈山路白粉病發(fā)病率與病情指數(shù)都高于其它3個(gè)點(diǎn)，原因可能是城市街道的樹(shù)木修剪頻率高，人流、車(chē)流都高于校園及風(fēng)景區(qū)，有利于病菌分生孢子的傳播，病害發(fā)生重。發(fā)病率和病情指數(shù)最低的為花溪區(qū)黃金大道，由于黃金大道地處河流邊，周?chē)参锓N類(lèi)及植被生態(tài)最為豐富，濕度相對(duì)其它5個(gè)調(diào)查地點(diǎn)也高，黃金大道的二球懸鈴木樹(shù)木高大、樹(shù)齡也最老，新生的新梢較少，發(fā)病最輕。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，修剪頻繁、長(zhǎng)勢(shì)弱的二球懸鈴木白粉病比修剪頻率低、長(zhǎng)勢(shì)好的發(fā)病率高；樹(shù)齡老、新梢、新葉少的比樹(shù)齡小、新梢、新葉多的發(fā)病率低。

通過(guò)對(duì)二球懸鈴木白粉病菌分生孢子形態(tài)觀(guān)察，為粉孢屬(Oidium)。張林燕[10]對(duì)在南京市懸鈴木白粉病病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果為有性型為懸鈴木白粉菌(E.platani)，無(wú)性型為粉孢屬一種(Oidiumsp.)。本文經(jīng)rDNA-ITS序列比對(duì)，結(jié)果與張林燕一致。筆者秋季定期采集白粉病葉觀(guān)察其病原菌，未發(fā)現(xiàn)有性階段。

本實(shí)驗(yàn)選用的7種藥劑在較低的濃度下對(duì)二球懸鈴木白粉病菌分生孢子的萌發(fā)都有較好的抑制作用，可考慮用80%硫磺WG、28%咪鮮·己唑醇SC等作為防治二球懸鈴木白粉病的藥劑。新栽植的二球懸鈴木要選抗病品種，選擇強(qiáng)壯長(zhǎng)勢(shì)好的種苗作為栽植的樹(shù)苗，在栽植前要先對(duì)樹(shù)苗噴藥預(yù)防，街道的樹(shù)木之間間距要控制好、距離不宜過(guò)近，盡量減少各樹(shù)木樹(shù)枝之間接觸摩擦，不宜頻繁的對(duì)樹(shù)木進(jìn)行修枝剪葉，修剪后要保證樹(shù)木能夠正常的生長(zhǎng)，修剪時(shí)應(yīng)盡量剪除在車(chē)輛流動(dòng)時(shí)能夠碰到的枝條葉片，減少摩擦接觸傳播病害，在冬季葉片脫落后及時(shí)掃除。在相鄰的街道不宜同時(shí)都以懸鈴木作為行道樹(shù)，避免栽植樹(shù)種單一性，可在街道樹(shù)周?chē)N其它植物，既增加美觀(guān)又增加植被豐富度，起到抑制行道樹(shù)病害大面積發(fā)生的作用。

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