蛹蟲草固體培養(yǎng)產(chǎn)子實體條件的優(yōu)化及其蟲草素含量測定

刁朝強(qiáng)，文庭池，廖 勇，康冀川，周建云，謝紅艷

(1.貴州省煙草公司貴陽市公司，貴州 貴陽 550025；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)部廢棄物基質(zhì)化利用重點實驗室，山東省農(nóng)業(yè)面源污染防控重點實驗室，山東 濟(jì)南 250100；3.貴州大學(xué)西南藥用生物資源教育部工程研究中心 貴州 貴陽 550025)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Fr.)是麥角菌科的藥用蟲生真菌，是我國名貴的中藥和新資源食品[1]，其所含藥用成分和多種藥效可與冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk.) Sacc.)相媲美。特別是其活性成分蟲草酸和蟲草素含量明顯高于冬蟲夏草[2]，使其得到廣泛關(guān)注。蟲草素即3’-脫氧腺苷是蛹蟲草產(chǎn)生的一種重要的次生代謝產(chǎn)物，據(jù)文獻(xiàn)報道其對枯草桿菌(Bacillussubtilis(Ehr) Cohn)、鳥型結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosisvar.aviumLehm.et Neum)、鼠艾氏腹水疣、人鼻咽癌KB細(xì)胞、人表皮樣疣及Hela細(xì)胞等皆有明顯拮抗或抑制作用[2]。經(jīng)國內(nèi)有關(guān)單位多次對蛹蟲草進(jìn)行的藥理藥化及臨床實驗證明[3]，其具有重要的滋補(bǔ)價值，對慢性支氣管炎、肝炎、高血壓、心臟病、腎炎、腎衰、癌癥以及消除疲勞、緊張等有顯著治療和預(yù)防作用。

張顯科等[4]通過實驗得出，大米栽培的蛹蟲草和野生冬蟲夏草含的重要無機(jī)元素，尤其是人體必須的無機(jī)元素，兩者含量很接近。蛹蟲草中各種維生素的含量比冬蟲夏草高，有的高出幾倍。兩者均含有18種氨基酸，蛹蟲草中每種氨基酸含量幾乎均高于天然冬蟲夏草，氨基酸總含量也高出冬蟲夏草幾倍。蛹蟲草中蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和超氧化物歧化酶(SOD)的含量接近或高出冬蟲夏草的含量。李楠[5]、彭國平[6]、江曉路[7]也有相似的結(jié)論，他們均認(rèn)為蛹蟲草與冬蟲夏草成分相近。

冬蟲夏草具有很高的藥用價值，但由于生長環(huán)境和寄生條件特殊而嚴(yán)格，加上近年來采挖過度，天然資源緊張，價格昂貴。因而許多學(xué)者致力于蛹蟲草的人工培養(yǎng)，本文目的在于對蛹蟲草固體培養(yǎng)條件進(jìn)行探索及優(yōu)化，并以工業(yè)液體發(fā)酵菌絲體作對比，對在最優(yōu)條件下培養(yǎng)出的蛹蟲草子實體及采后培養(yǎng)基中蟲草素的含量進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種 蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Fr.)供試菌株4株，編號A、B、C、D，保藏在貴州大學(xué)西南藥用生物資源教育部工程研究中心。

1.1.2培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL。搖瓶液體母種培養(yǎng)基：蛋白胨2%，蔗糖 2%，MgSO4·7 H2O 0.05%，KH2PO40.1%，水1000 mL。

米飯培養(yǎng)基營養(yǎng)液：Ⅰ葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，檸檬酸銨1 g，水1000 mL。Ⅱ 蛋白胨12.5 g，甘油5 g，酵母浸膏5 g，20%馬鈴薯提取液1000 mL。米飯培養(yǎng)基：大米25 g，麥麩1.3 g，玉米粉0.4 g，豆粉0.4 g，蠶蛹粉0.4 g，裝入350 mL的透明玻璃罐頭瓶中，分別加入上述營養(yǎng)素液，用耐高溫白色聚丙烯膜封口。

1.2 儀器與試劑

儀器：超凈工作臺SA-1480-Ⅱ，多段編程光照培養(yǎng)箱GXZ型，電熱鼓風(fēng)干燥箱101-2AB，美國LABALLIANCE超聲波清洗器，美國Scientific systems公司高效液相色譜儀；試劑：甲醇為色譜純，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1料水比篩選 該試驗設(shè)計11個料水比(基質(zhì)/水=w/v)，分別為：1∶1.0，1∶1.2，1∶1.4，1∶1.6，1∶1.8，1∶2.0，1∶2.2，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0。將上述配比培養(yǎng)基裝入350 mL的罐頭瓶中，121℃高壓滅菌25 min，待用。

1.3.2不同菌株、培養(yǎng)基及不同的接種方式比較 將蛹蟲草4個不同的菌株A，B，C，D活化后，分別制作為孢子懸液(1)、液體種(2)和斜面種(3)，分別將3種母種接種到Ⅰ，Ⅱ米飯培養(yǎng)基上(表1)。

表1 不同菌株、接種方式、培養(yǎng)基的組合Tab.1 Combination of strains， inoculation method and culture medium

注：A， B， C， D代表不同菌株；Ⅰ、Ⅱ代表不同培養(yǎng)基；1、2、3代表不同的接種方式。

1.3.2.1 菌絲培養(yǎng) 接種后移入培養(yǎng)室，溫度控制在23～25℃，空氣相對濕度為65～70%，黑暗培養(yǎng)，15 d左右菌絲封底，此時室內(nèi)增加散射光，5～7 d后培養(yǎng)料表面或四周有桔黃色色素形成，即進(jìn)入子實體管理時期。

1.3.2.2 子實體管理 菌絲轉(zhuǎn)色完成后，為刺激子實體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10 h， 溫度每天18℃，10 h/24℃，14 h交替，相對濕度提高至80%左右，每天通風(fēng)30 min以補(bǔ)充新鮮空氣，蛹蟲草子座長出后，增加光照強(qiáng)度，溫度保持22℃左右，空氣濕度85%左右，每天通風(fēng)換氣30 min。

1.3.3蟲草素含量測定

1.3.3.1 色譜分析條件 色譜柱采用Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)反向硅膠柱，流動相：10 mM KH2PO4溶于甲醇/雙蒸水(15∶85)，HPLC測定時流動相流速設(shè)定為1 mL/min；檢測波長為254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL[1]。

1.3.3.2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用雙蒸水定容至50 mL，則該溶液濃度為100 μg/mL，再依次稀釋，得到濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后采用HPLC測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液，流動相流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30℃的色譜條件下，進(jìn)樣20 μL后測定峰面積，以峰面積-濃度做圖，得回歸方程 C=3.411 92×10-5A-1.284 60， R2=0.999 6。

1.3.3.3 子實體與采后培養(yǎng)基及工業(yè)液體發(fā)酵蛹蟲草菌絲中蟲草素含量的測定 將成熟的蛹蟲草子實體、采收后的培養(yǎng)基及工業(yè)液體發(fā)酵菌絲體50℃烘干，用食品粉碎機(jī)粉碎，精密稱取粉末各0.2 g，置于具塞試管中，加入雙蒸水10 ml，超聲處理30 min，后在5000 g下離心15 min，最后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾除去固體雜質(zhì)后用高效液相色譜法檢測其中蟲草素的含量。HPLC測定時流動相流速設(shè)定為1 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL。所有結(jié)果均為三個平行樣數(shù)值的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比篩選

按各料水比將大米和水裝入罐頭瓶，高壓滅菌后，根據(jù)米的軟硬度和透氣性，比較篩選出1∶1.6效果最好，且子實體培養(yǎng)實驗證明，1∶1.6料水比的米飯培養(yǎng)基內(nèi)部的水分足夠蛹蟲草子實體形成所需，培養(yǎng)過程不必再補(bǔ)充水分。

2.2 不同菌株、培養(yǎng)基及不同的接種方式比較

不同菌株子實體產(chǎn)量如表2，菌株A每瓶子實體產(chǎn)量最高，菌株B次之，菌株 C和菌株D只產(chǎn)生1～2根或無。菌株A培養(yǎng)成功的成熟蛹蟲草子實體如圖1所示。

孢子懸液方式接種的實驗處理菌絲封底時間為14 d，搖瓶液體母種接種的菌絲封底時間為18 d，而固體斜面菌種接種的封底時間為24 d，比孢子懸液方式接種的處理晚10 d。

與II培養(yǎng)基上培養(yǎng)的蛹蟲草相比，I培養(yǎng)基上形成的原基多，子實體高且粗壯。

綜合菌株、接種方式、培養(yǎng)基三個因素，篩選出進(jìn)行蛹蟲草子實體固體培養(yǎng)出草率和生物轉(zhuǎn)化率較高，周期短的組合，即菌株A，Ⅰ培養(yǎng)基，孢子懸液接種(即A1Ⅰ組合，其干重產(chǎn)量達(dá)到2.72 說g/瓶)。

2.3 蟲草素含量測定

在最優(yōu)化的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，得到的蛹蟲草子實體、采后培養(yǎng)基與從企業(yè)獲得的工業(yè)液體發(fā)酵蛹蟲草菌絲體一并烘干、粉碎后，用高效液相色譜法測得蛹蟲草子實體的蟲草素含量為10.22 mg/g，采后培養(yǎng)基的蟲草素含量為2.04 mg/g，工業(yè)液體發(fā)酵菌絲的蟲草素含量為7.06 mg/g。子實體的蟲草素含量是工業(yè)液體發(fā)酵菌絲中蟲草素含量的1.45倍，是采后培養(yǎng)基中蟲草素含量的5倍，與溫魯?shù)萚8]發(fā)表的人工栽培采后培養(yǎng)基的蟲草素含量比子實體還要高的結(jié)果相反。

表2 不同菌株子實體產(chǎn)量比較Tab.2 Fruiting body yield of different strains

圖1 蛹蟲草菌株A成熟的子實體Fig.1 Mature fruiting bodies of strain A of Cordyceps militaris

3 討 論

蛹蟲草不同菌株在人工米飯培養(yǎng)基上產(chǎn)生子實體的能力差別很大，菌株A是菌株B的1.75倍(達(dá)到2.49 g/瓶)，菌株A的產(chǎn)量和文庭池[9]報道的接近，而菌株 C和菌株D幾乎不產(chǎn)子實體。因此規(guī)模生產(chǎn)前必須要做產(chǎn)子實體能力的菌株篩選實驗。

孢子懸液中的孢子濃度可達(dá)到107/mL，所以孢子懸液接種發(fā)菌快，生長周期短，適于生產(chǎn)上應(yīng)用。

蛹蟲草子實體中蟲草素含量比采后培養(yǎng)基和工業(yè)液體發(fā)酵菌絲體中蟲草素含量都高，但是子實體產(chǎn)量較少，成本較高。因此，在野生冬蟲夏草、蛹蟲草資源不斷減少的情況下，為更好更有效地開發(fā)利用蟲草資源，可以利用殘余的蛹蟲草大米培養(yǎng)基提取蟲草素及其他活性物質(zhì)[10，11]。

固體培養(yǎng)出的蛹蟲草子實體產(chǎn)量高，但由于所用的罐頭瓶狹細(xì)，成熟子實體彎曲，外觀性狀不夠好，固體培養(yǎng)的容器需進(jìn)一步改善。

相同條件下，蛹蟲草子實體產(chǎn)量具不穩(wěn)定性，可能與蛹蟲草菌種退化及遺傳性狀相關(guān)，具體原因需進(jìn)一步深入研究。菌種退化是蛹蟲草子實體產(chǎn)業(yè)化中較為嚴(yán)重的問題，表現(xiàn)為菌種使用一段時間之后毫無征兆的不長子實體、子實體產(chǎn)量或有效成分含量嚴(yán)重下降，且菌種退化往往是不可逆的，因此會給蛹蟲草的生產(chǎn)帶來很大的損失[1，12]。目前主要是通過新菌株分離、減少傳代次數(shù)、菌株復(fù)壯和采用適當(dāng)?shù)木N保藏方法來減少菌種退化問題[13，14]。

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