液-液萃取結合G C-M S對牛欄山清香型白酒微量成分的分析

王 瑛，周 森，朱婷婷，王 宇，梅興華，魏金旺

(北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301)

中國白酒是指以糧谷為主要釀造原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的蒸餾酒[1]。白酒的釀造歷史悠久，可以追溯到距今4000多年前的龍山文化時期[2]。在幾千年的傳承發(fā)展中，中國白酒形成了自己獨有的固態(tài)發(fā)酵（Solid-state fermentation）方式和蒸餾工藝（Distillation），與法國的白蘭地（Brandy），俄國的伏特加（Vodka）和蘇格蘭的威士忌（Whisky），金酒（Gin），朗姆酒（Rum）并稱為世界六大蒸餾酒[3]。中國白酒由于獨特的風味和口感受到消費者的親睞。牛欄山二鍋頭采用東北地區(qū)優(yōu)質(zhì)高粱品種為原料,精心挑選小麥和豌豆低溫制曲,將傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代釀造技術相結合,經(jīng)過復雜而科學的發(fā)酵工藝,生產(chǎn)出色澤清亮透明、清香純正、醇甜柔和的白酒[4]，是北京白酒的代表產(chǎn)品,并成為國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。據(jù)文獻報道[5-6]，白酒中已鑒定的微量成分不少于300種,但其含量僅占約2%。這些微量成分雖然含量極少，但對白酒質(zhì)量卻有極大影響，決定白酒的香氣和口味,構成白酒的不同香型和風格，同時也是白酒中健康因子的來源[7]。隨著檢測技術的發(fā)展，萜烯是近幾年發(fā)現(xiàn)普遍存在于白酒中的微量成分。萜烯類化合物具有廣泛的生物活性，也是白酒中重要的健康因子[8]。對于這些成分的鑒定，液-液萃取法具有萃取效率高和富集成分種類多的優(yōu)點，結合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術所具有的強大分離和定性能力成為該研究領域最有效的分析手段。本研究以牛欄山清香型白酒為原料,采用多溶劑液-液萃取方法利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對其微量組分進行鑒定,旨在為牛欄山白酒微量成分的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛欄山二鍋頭酒原酒70%vol（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠生產(chǎn)）。

1.2 主要儀器與試劑

島津GC-MS-QP2010 Ultra氣相色譜儀（日本島津公司）；DC-12氮氣吹掃儀（上海安譜科學儀器有限公司）；賽墨飛世爾PLR-1006冰箱(Thermo Fisher Scientific公司)；分液漏斗；有機試劑均為色譜純（Merck,德國默克公司）。

1.3 實驗方法

液液萃取：量取100 mL白酒酒樣，分別量取100 mL正己烷萃取1次,然后用100 mL乙醚再萃取1次，合并有機相。最后將剩余酒樣用超純水稀釋至10%vol，加入NaCl溶液至飽和，再用100 mL戊烷∶乙醚1∶1(v/v)進行最后一次萃取，將3次萃取的有機相合并，通過氮吹儀濃縮至2 mL，冰箱存儲，備用。

GC條件：FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分離的色譜條件：氣相色譜進樣口和檢測器溫度為250℃，載氣為氦氣，流速2 mL/min；進樣量為2 μL，不分流進樣。

色譜柱升溫程序：初溫50℃，保持2 min，以3℃/min升至170℃，保持2 min，再以6℃/min升至230℃，保持15 min。HP-5柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm)分離的色譜條件：初溫50 ℃，保持2 min，再以6℃/min升至230℃，保持15 min。其他條件同F(xiàn)FAP柱。

質(zhì)譜條件：EI電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：35～500 amu。

定性方法：將分離得到的單組份色譜峰對應的質(zhì)譜圖與工作站NIST Library譜庫中質(zhì)譜圖進行檢索匹配,匹配率與鑒定的相對準確度大于85%。

2 結果與分析

通過液液萃取-結合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)牛欄山清香型白酒主要是由酯類化合物、醇類化合物、酸類化合物、醛類化合物和烷烴類化合物、萜烯類及酚類化合物等構成。由表1可以看出，在牛欄山白酒中檢出49種酯類成分，是主要香味物質(zhì)。其包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯等。這些酯類主要來源于酒醅發(fā)酵過程中釀酒微生物對糧食作物中淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等生物大分子的代謝。實驗對本廠清香型白酒發(fā)酵過程中主體風味物質(zhì)的微生物代謝分析認為，清香型白酒的重要風味物質(zhì)乙酸乙酯主要來源于釀酒酵母。共檢測到19種醇類物質(zhì)，主要是高級醇。醛酮類物質(zhì)共檢測到11種，主要有己酮、庚酮、壬酮及壬醛、癸醛等。酸類是牛欄山白酒重要協(xié)調(diào)成分，同時也具有擴張血管、延緩血管硬化的功能，并具有殺菌抗病毒的作用，能促進胃液分泌，降血脂和膽固醇的作用，但是由于萃取過程中用的都是非極性溶劑，對酸的提取效果較差，所以只檢測到6種長鏈酸。在酒樣中檢測到5種酚類物質(zhì)及8種萜烯類功能因子，其中酚類化合物可能大部分是來源于木質(zhì)素的水解產(chǎn)物，萜烯類物質(zhì)可能是來源于釀酒原料及發(fā)酵過程中的微生物代謝產(chǎn)生。這類化合物具有抗癌癥[9]、抗病毒[10]以及抗炎癥[11]等活性。上述微量成分構成了牛欄山清香型白酒的主體成分，賦予其獨特的風格特征。

3 結論

本實驗從白酒最本質(zhì)的特征——微量化合物成分研究著手，采用液液萃取結合GC-MS分析技術對牛欄山清香型白酒的微量成分進行初步研究，共有157種化合物被檢出。鑒定了其中的109種化合物。包括49種酯類化合物，19種醇類、6種醛類、5種酮類物質(zhì)、6種酸類、11種烴類、8種萜烯類、5種酚類化合物（見表1）。這些微量成分的鑒定將有助于確認牛欄山清香白酒的特征風味物質(zhì)，進而揭示清香型牛欄山白酒的關鍵風味物質(zhì)和本質(zhì)特征。實驗確定牛欄山白酒中關鍵微量化合物，為清香型白酒的風味成分提供理論依據(jù)，對全面認識和理解白酒的風味組分的物質(zhì)基礎和風味特征具有重要價值。為進一步深入探索特征風味物質(zhì)的形成途徑和機理，強化白酒中的主體風味物質(zhì)，奠定理論基礎。