高通量測(cè)序法對(duì)不同地域濃香型大曲微生物結(jié)構(gòu)的分析

譚崇堯，徐 軍

（湖北枝江酒業(yè)股份有限公司，湖北枝江443200）

中國(guó)白酒歷史悠久，工藝獨(dú)特，是中華民族的瑰寶。中國(guó)白酒受氣候、土質(zhì)、水質(zhì)等自然因素以及歷史、文化、消費(fèi)習(xí)慣等社會(huì)因素的影響，各地白酒更呈現(xiàn)不同的風(fēng)格組成，在科技工作者及釀酒企業(yè)的共同努力下，中國(guó)白酒逐步形成和確立了醬香型、清香型、濃香型、米香型、鳳香型等十二大香型。濃香型大曲酒占全國(guó)白酒產(chǎn)銷量的70%，國(guó)家級(jí)名酒中濃香型約占50%。由于濃香型白酒市場(chǎng)大，生產(chǎn)廠家多，目前行業(yè)公認(rèn)的濃香型白酒在風(fēng)格上又劃分為北方派、江淮派和川派等。不同派別的濃香型白酒各有特點(diǎn)。2015年，喬曉梅[1]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了清香型白酒大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)。本文以濃香型白酒為研究對(duì)象，利用目前較為先進(jìn)的高通量測(cè)序分析技術(shù)對(duì)不同地域的大曲真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行取樣分析，樣品來(lái)源于北方派、長(zhǎng)江中游派、江淮派和川派等代表企業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：來(lái)自北方派、長(zhǎng)江中游派、江淮派和川派等代表企業(yè)大曲。

試劑：PBS緩沖溶液（pH7.0），無(wú)水乙醇，氯仿，10×TE Buffer，1%的瓊脂糖凝膠，Trans15k Marker，DL2000 DNA Marker，2×PCR Mix Buffer。

儀器設(shè)備：TG16-W微量高速離心機(jī)，PCR儀（ABI），凝膠成像儀，電泳槽，Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

大曲樣品的準(zhǔn)備、大曲總DNA的提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序、文庫(kù)建立及數(shù)據(jù)分析見(jiàn)參考文獻(xiàn)[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地域大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析（圖1）

從圖1可以看出，長(zhǎng)江中游地區(qū)和江淮地區(qū)的濃香型白酒大曲真菌主要為曲霉屬，數(shù)量占50%以上；北方地區(qū)和四川地區(qū)的白酒大曲差異較大，地域共性不如長(zhǎng)江中游和江淮區(qū)域明顯，如川派的15號(hào)、17號(hào)和19號(hào)的優(yōu)勢(shì)真菌為熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬這類高溫菌，而16號(hào)和18號(hào)則為曲霉屬；而北方派主要呈現(xiàn)以酵母（異常維克漢姆酵母）和嗜熱高溫菌（熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬）為主要優(yōu)勢(shì)菌的差異。

圖1 不同地域濃香型白酒大曲真菌群落結(jié)構(gòu)

2.2 不同地域大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析（圖2）

圖2 不同地域濃香型白酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

不同地域濃香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析如圖2，從圖2中可以看出，同為濃香型白酒大曲，微生物結(jié)構(gòu)有其相同地方，但各企業(yè)大曲微生物構(gòu)成均存在差異。濃香大曲中原核微生物主要為厚壁菌門(mén)，其中乳酸菌群為優(yōu)勢(shì)菌，部分樣品還有高溫嗜熱菌、丙酸菌和Rheinheimera。

圖3 四川地區(qū)濃香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 川派大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

從屬分類水平上，四川地區(qū)5種大曲的主要微生物結(jié)構(gòu)數(shù)量圖見(jiàn)圖3，熱圖見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，樣品1的數(shù)量超過(guò)10%的細(xì)菌為檸檬酸菌屬（Citrobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄酒菌屬（Staphylococcus)和丙酸菌屬（Propionibacterium），數(shù)量分別占15.7%、15.4%、12.1%和11.6%；樣品2的數(shù)量超過(guò)10%的細(xì)菌為丙酸菌屬、Rheinheimera和Desmospora3個(gè)菌屬，數(shù)量分別占20.46%、18.49%和12.0%；樣品3的數(shù)量超過(guò)10%的細(xì)菌為乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和芽孢桿菌屬（Bacillus），數(shù)量分別占20.28%、10.59%和10.28%；樣品4的數(shù)量超過(guò)10%的細(xì)菌為Rheinheimera、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，數(shù)量分別占38.74%、14.26%和12.64%；樣品5的數(shù)量超過(guò)10%的細(xì)菌僅為高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），數(shù)量占62.35%。

濃香型大曲的微生物組成復(fù)雜，主要來(lái)源于原料和生產(chǎn)環(huán)境，受制曲工藝影響，如制曲溫度。樣品5為典型的高溫曲，其中高溫放線菌屬數(shù)量超過(guò)60%，芽孢桿菌屬含量為7.77%，這兩種菌都為嗜熱微生物，能夠在溫度較高的制曲條件下生長(zhǎng)、繁殖和代謝，其產(chǎn)生的酶在高溫條件下具有很高的活性和熱穩(wěn)定性，是白酒特殊風(fēng)味物質(zhì)的重要來(lái)源之一。

數(shù)量超過(guò)10%的細(xì)菌在5個(gè)大曲中出現(xiàn)兩次的菌屬為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、丙酸菌屬和Rheinheimera；除此之外，含量較高的菌還有葡萄酒菌屬、明串珠菌屬、高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬等。

圖4 四川地區(qū)濃香型大曲細(xì)菌群落熱圖分析

2.2.2 北方派大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

從屬分類水平上，北方地區(qū)5種大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)數(shù)量圖見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，22號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為糖球菌和高溫放線菌，數(shù)量分別占53.7%和23.0%；24號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為葡萄球菌和真絲菌，數(shù)量分別占55.8%和22.8%；12號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為高溫放線菌和丙酸菌，數(shù)量分別占40.9%和27.3%；13號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為鏈孢子菌屬和丙酸菌屬，數(shù)量分別占42.7%和21.5%；14號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬和葡萄球菌屬，數(shù)量分別占27.2%、20.8%和14.4%。熱裸單胞菌屬、高溫放線菌屬、真絲菌屬、鏈孢子菌屬和芽孢桿菌屬都為嗜熱高溫菌，5個(gè)樣品的高溫菌數(shù)量分別占23.8%、23.1%、41.6%、43.5%和27.4%。因此，這些高溫菌為北方大曲的優(yōu)勢(shì)菌屬，另有魏斯氏菌屬和丙酸菌。

2.2.3 江淮派大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

從屬分類水平上，江淮地區(qū)大曲的主要微生物結(jié)構(gòu)數(shù)量圖見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，10號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為乳球菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬等，其中乳酸菌群數(shù)量占69.8%，芽孢桿菌屬占20.8%；1號(hào)樣品的優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌屬、鏈孢子菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌和片球菌，其中乳酸菌數(shù)量占63.4%，其次為鏈孢子菌屬，數(shù)量為22.6%。

圖5 北方地區(qū)濃香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

圖6 江淮地區(qū)濃香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.4 長(zhǎng)江中游大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

長(zhǎng)江中游地區(qū)大曲的主要微生物結(jié)構(gòu)比例圖見(jiàn)圖7，如圖7所示，優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌群。

圖7 長(zhǎng)江中游地區(qū)濃香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

3 總結(jié)

濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的微生物和酶主要來(lái)源于大曲，而微生物群落分布和生長(zhǎng)與地域、氣候、環(huán)境條件等息息相關(guān)。本研究針對(duì)不同地區(qū)濃香型白酒大曲中微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。綜上結(jié)果表明，濃香型酒曲中原核類微生物種類占總體69%，數(shù)量占總數(shù)31%。濃香大曲中原核微生物主要為厚壁菌門(mén)，其中乳酸菌群為優(yōu)勢(shì)菌，部分樣品還有高溫嗜熱菌、丙酸菌和Rheinheimera。