傳統(tǒng)與仿生機制高溫曲培養(yǎng)過程中生化指標的對比研究

張 健，李 波，程平言，向祖祥，胡 峰

(貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水564622）

高溫大曲在醬香白酒釀造過程中起到糖化劑、發(fā)酵劑、增香劑的作用[1]，“曲乃酒之骨”，好曲出好酒，優(yōu)質(zhì)高溫曲對白酒的產(chǎn)質(zhì)量有重要的作用。高溫大曲為醬香酒釀造過程的呈香提供了多種香味前體物質(zhì)，從而利于醬酒風味的形成。大曲的品質(zhì)與曲房的培養(yǎng)過程密不可分，培養(yǎng)過程中曲坯微生物的種類、數(shù)量以及理化指標是反映曲坯發(fā)酵好壞的關鍵因素。壓制成型的曲坯入曲房后，通過自然接種發(fā)酵、富集曲房環(huán)境中微生物形成了復雜的發(fā)酵微生物菌體系，經(jīng)過30多天的發(fā)酵培養(yǎng)，形成了富含菌、酶、物三系[2]的曲塊，繼續(xù)貯存4～6個月制成成品曲，為釀造好酒奠定了基礎。

傳統(tǒng)人工制曲方式，勞動強度大，生產(chǎn)效率低，人工成本高。隨著白酒行業(yè)機械化的推進，習酒在節(jié)能降耗的背景下，創(chuàng)新高溫制曲工藝，在行業(yè)當前的制曲機的基礎上，提出仿生學原理，最終與四川宜賓岷江機械廠共同合作，成功開發(fā)了仿生機械壓曲機[3]，壓制過程和人工踩曲相似。仿生機制曲的應用，能否達到人工曲品質(zhì)，滿足生產(chǎn)需求，曲坯的培養(yǎng)發(fā)酵過程至關重要，本研究通過對培養(yǎng)發(fā)酵過程中仿生機制曲曲坯微生物的數(shù)量、種類以及理化指標（水分、酸度、發(fā)酵力、液化力、酯化力、糖化力）進行實驗分析，并與同期培養(yǎng)的傳統(tǒng)曲各相應指標進行對比分析研究，從而發(fā)現(xiàn)它們之間的差異，為仿生機制曲的好壞提供參考，保障仿生機制曲在釀酒中的投產(chǎn)應用效果，通過本研究進一步豐富習酒釀酒機械化研究體系、完善了習酒釀酒微生態(tài)體系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 曲樣來源

習酒公司高溫制曲車間同一生產(chǎn)輪次傳統(tǒng)班和機械制曲班的曲樣。

1.1.2 試劑

微生物分離培養(yǎng)試劑見（1.1.3）；理化檢測試劑參照《白酒生產(chǎn)技術全書》[4]《釀酒大曲通用分析方法》[5]的使用試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

細菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉2 g，pH值7.2～7.4，蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養(yǎng)基（霉菌）：蛋白胨0.5 g，葡萄糖1 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.05 g，孟加拉紅0.003 g，瓊脂粉2 g，氯霉素0.01 g，pH值7.0～7.4，蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min。

酵母分離培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉0.5 g，瓊脂粉2 g，青霉素0.01 g，儲備液A4 mL，儲備液B 0.1 mL，儲備液C 0.1 mL，蒸餾水100 mL，pH=6.5，121℃滅菌20min，滅菌后加儲備液C0.1mL。

儲備液A：K2HPO41.1 g，KCl 1.0 g，CaCl20.3 g，MgSO40.2 g，蒸餾水100 mL。

儲備液B：FeCl30.25 g，MnSO40.12 g，蒸餾水100 mL。

儲備液C：0.44 g溴甲酚綠溶于20 mL無水乙醇。

1.2 儀器設備

主要設備：電子天平，分析天平，超凈工作臺，標準移液槍，生化恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫干燥箱，恒溫水浴鍋，秒表，白瓷板，電子萬用爐。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物平板計數(shù)實驗方法

（1）曲樣的采集方法

分別采取人工和仿生機制曲曲房第一次翻曲、第二次翻曲、拆曲時的曲樣，樣品保存于無菌密封袋，各取200 g，粉碎混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）曲樣的前處理

將采集的樣品四分法稱取10 g，加入90 mL無菌0.9%的生理鹽水中，振蕩搖勻，置于恒溫搖床，以適當?shù)乃俣?，培養(yǎng)活化12 h后，取出靜置。進行梯度稀釋得到菌懸液，取各濃度的菌懸液0.1 mL分別涂布在提前滅菌備用的細菌、霉菌、酵母平板上。

（3）微生物培養(yǎng)分離與計數(shù)

細菌分離平板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后開始記錄細菌的總數(shù)與種類，酵母分離平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后記錄總數(shù)與種類。霉菌分離平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3～7 d觀察記錄總數(shù)與種類。

根據(jù)仿生機械曲和人工曲不同培養(yǎng)時間曲樣所得微生物種類和數(shù)量進行對比分析，得出兩種曲微生物指標間的異同。

1.3.2 理化指標的檢測方法

參照《白酒生產(chǎn)技術全書》[4]《釀酒大曲通用分析方法》[5]。

（1）水分測定

稱取10.0 g曲樣于干燥潔凈的稱量皿中，記錄總重量，將其置于溫度為125℃的恒溫干燥箱內(nèi)，烘2 h直至恒重，取出放入干燥器中冷卻30 min，稱重，記錄重量，計算大曲水分（水分含量以百分比表示）。

（2）酸度測定

稱取約10 g曲樣，置于250 mL三角瓶中，記錄樣品重量，準確加水100 mL，攪勻，在室溫下浸泡15 min。每隔5 min攪拌1次。用雙層紗布或脫脂棉過濾浸提液，棄去初濾液20 mL，用三角瓶接取濾液備用，即為待測液。

準確吸取10.0 mL待測液于250 mL三角瓶中，加水約20 mL，搖勻，加2滴酚酞作為指示劑，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至呈微紅色，且30 s不褪色。記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，根據(jù)消耗體積計算結果（酸度為10 g絕干大曲消耗0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫摩爾數(shù)，單位為mmol/10 g）。

（3）發(fā)酵力測定

取玉米粉原料50 g，加水250 mL，混勻，蒸煮1～2 h，使呈糊狀，冷卻到60℃。加入原料量15%的大曲粉，再加50 mL 60℃的水攪勻。在60℃下糖化3～4 h，取出1滴與0.1 mol/L碘標準溶液反應直至不顯藍色為止。即為糖化液。

用移液管吸取糖化液50 mL于250 mL三角瓶內(nèi)，用石蠟密封發(fā)酵瓶，無菌條件下加入曲粉1 g，發(fā)酵瓶中加入5 mol/L硫酸溶液10 mL，用石蠟密封發(fā)酵瓶，擦干瓶外壁，在分析天平上稱量，記錄稱量結果，然后放入30℃恒溫箱中發(fā)酵48 h。取出發(fā)酵瓶，輕輕搖動，使二氧化碳全部逸出，在同一條件下稱量，記錄稱量結果，計算發(fā)酵力大?。ㄔ?0℃、48 h內(nèi)0.5 g大曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的二氧化碳克數(shù)為一個發(fā)酵力單位，符號為U，以“g/0.5 g·48 h”表示）。

（4）酯化力測定

吸取己酸-乙醇溶液100 mL，于250 mL蒸餾瓶中，加入相當于絕干樣品5 g曲粉，在恒溫箱中35℃酯化100 h，取出后加水50 mL。加熱蒸餾，接出餾出液100 mL，作為酯化力含量的測定液。吸取50 mL餾出液，加入酚酞指示劑3滴，用氫氧化鈉標準溶液中和至微紅色出現(xiàn)，準確加入氫氧化鈉標準溶液25 mL，沸水浴中回流30 min，冷卻后用硫酸標準溶液滴定到微紅色消失為終點，計算酯化力（5 g大曲在35℃，經(jīng)過100 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個酯化力單位，符號為U，以“mg/50 g·100 h”表示）。

（5）糖化力測定

稱取相當于10 g絕干曲樣品于大燒杯中，根據(jù)測定的曲樣水分查得應加水量，再加入20 mL pH 4.6乙酸-醋酸鈉緩沖液充分攪拌，在35℃水浴中浸泡1 h，用濾紙過濾，濾液備用，于100 mL試管中加3%可溶性淀粉25 mL，置于35℃水浴中保溫15 min，加大曲浸出液5 mL，迅速搖勻計時，并立即吸取5 mL混合液注入盛有斐林甲、乙液各5 mL和20 mL蒸餾水的三角瓶中，剩余的混合液繼續(xù)在35℃水浴中準確糖化1 h，立即吸出5 mL糖化液注入另一盛有斐林甲、乙液各5 mL和20 mL蒸餾水的三角瓶中，定糖（在35℃、pH 4.6條件下，1 g絕干曲1 h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個糖化力單位，符號為U，以“mg/g·h”表示）。

（6）液化力測定

稱取相當于10 g絕干曲樣品于大燒杯中，用緩沖液以35℃浸泡30 min，用濾紙過濾，濾液為供試酶液。吸取20 mL 2%可溶性淀粉溶液和5 mL pH 6.0緩沖液溶液于25×100 mL試管中，于水浴中預熱60 min，準確加入5 mL稀釋酶液，立即計時。充分搖勻后，定時用滴管取出約0.5 mL反應液，滴入預先盛有稀碘液的白瓷板中，呈色反應由藍紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，直至與標準比色溶液顏色相同為止，即為反應終點，記錄反應時間，計算液化力（在35℃，pH 6條件下，1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個液化力單位，符號為U，以“g/g·h”表示）。

根據(jù)實驗方法測定仿生機制曲與人工曲培養(yǎng)不同時間的各理化指標數(shù)據(jù)，對比分析兩者的差異，得出實驗結論。

2 結果與分析

2.1 機制曲與人工曲微生物培養(yǎng)結果與分析（表1）

表1 人工曲與機制曲的微生物種類對比分析

通過仿生機制曲與人工曲微生物的分離培養(yǎng)實驗，從表1數(shù)據(jù)分析表明：第一次翻曲時兩者的微生物培養(yǎng)結果細菌的種類最多，有14種，霉菌、酵母的種類較少，兩者主要微生物細菌、酵母的種類基本一致；隨著培養(yǎng)時間的延長，到拆曲出房時，兩者的主要微生物細菌、霉菌、酵母的種類都明顯比第一次翻曲時減少，但細菌種類仍然最多，機制曲8種，人工曲7種，霉菌均為兩種，酵母的種類最少，都只有1種。通過實驗得出：仿生機制曲3個培養(yǎng)時期的主要微生物種類均和人工曲相應培養(yǎng)時期的微生物種類保持基本一致，差異小，因此仿生機制曲微生物種類達到人工曲的標準，采用仿生機制曲不會影響高溫大曲微生物的種類。

表2 人工曲與仿生機制曲的微生物數(shù)量對比分析

從表2微生物數(shù)量實驗數(shù)據(jù)對比分析表明：兩者的微生物數(shù)量第一次翻曲時最多，細菌的數(shù)量最多，霉菌、酵母的數(shù)量較少，細菌數(shù)量到達106，霉菌、酵母的數(shù)量為103；隨著培養(yǎng)時間的延長，第二次翻曲時兩者的霉菌數(shù)量增多，達到104，基本相當，拆曲出房時，兩者的主要微生物的數(shù)量都變少，但細菌數(shù)量仍然最多，為105，霉菌為103，酵母為102，酵母最少。通過實驗數(shù)據(jù)分析得出：仿生機制曲3個培養(yǎng)時期的主要微生物數(shù)量均和人工曲相應培養(yǎng)時期的微生物數(shù)量保持一致，說明仿生機制曲微生物數(shù)量達到人工曲微生物的標準，采用仿生機制曲培養(yǎng)過程中微生物的數(shù)量不會受到影響，仿生機制曲生產(chǎn)達到公司高溫大曲微生物的標準。

通過微生物實驗證明仿生機制曲和人工曲曲房培養(yǎng)過程中3個時間段的微生物種類、數(shù)量都保持一致，說明仿生機制曲不影響高溫大曲的微生物生長。

2.2 理化指標的結果與分析（表3）

表3 人工曲與仿生機制曲理化指標對比分析

表3實驗結果表明：仿生機制曲的3個培養(yǎng)時期的主要理化指標水分、酸度、糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力和人工曲的指標基本保持一致。拆曲出房時人工曲的水分含量為12.7%，酸度0.79 mmol/10 g，糖化力336.45 U，液化力1.29 U，酯化力18.62 U，發(fā)酵力1.62 U；仿生機制曲的水分含量為13.2%，酸度0.67 mmol/10 g，糖化力318.87 U，液化力0.84 U，酯化力20.85 U，發(fā)酵力1.64 U；通過數(shù)據(jù)分析得出，仿生機制曲與人工曲在第一次、第二次翻曲時各理化指標保持一致，而拆曲出房時兩者的各項指標同樣趨于一致，相差不大，仿生機制曲理化指標達到人工曲標準，達到公司標準要求。

3 討論

醬香型大曲培養(yǎng)過程中主要微生物細菌、霉菌、酵母的種類與數(shù)量可以直接反映曲房中曲坯的發(fā)酵是否正常，曲坯的發(fā)酵是復合發(fā)酵過程，培養(yǎng)過程中微生物種類越豐富，數(shù)量越多，成品曲積累的各種酶系越豐富，成品曲中微生物的代謝產(chǎn)物越多，為釀酒提供的前體物質(zhì)越多[6]。

理化指標中水分、酸度、液化力和糖化力反映醬香型大曲是否成熟；發(fā)酵力和酯化力是醬香型大曲的生化性能，反映了醬香型大曲品質(zhì)。通過對比分析仿生機制曲與人工曲培養(yǎng)發(fā)酵過程中3個時期的各項理化指標，可以提前預判最終成品曲的品質(zhì)，因此通過微生物指標、理化指標的分析對比可知，仿生機制曲與人工曲存在品質(zhì)差異[7]。

從實驗結果可以推斷，第一，仿生機制曲和人工曲在發(fā)酵培養(yǎng)的各階段微生物種類和數(shù)量基本一致，表明仿生機制曲不會影響高溫大曲的微生物種類和數(shù)量；第二，通過對理化指標的實驗測定，結果表明兩者各樣品的理化指標雖有差異，但總體比較接近，且最終拆曲出房時所有理化指標數(shù)值大小均在企業(yè)標準范圍內(nèi)，符合醬香型大曲的理化指標符合地方標準DB 52/T871中的規(guī)定。

本研究表明，仿生機械制曲能夠達到人工曲微生物指標、理化指標要求，對高溫大曲的品質(zhì)沒有不利影響。

為了加快白酒行業(yè)兩化融合，推進白酒行業(yè)機械化進程，習酒仿生機制曲的開發(fā)成功地為同行提供了技術參考。仿生機制曲能夠達到人工曲質(zhì)量標準，符合醬香型白酒的生產(chǎn)需要，同時也能節(jié)能降耗，節(jié)約成本，提高工作效率。