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    傳統(tǒng)與仿生機制高溫曲培養(yǎng)過程中生化指標的對比研究

    2018-10-16 08:06:10程平言向祖祥
    釀酒科技 2018年9期
    關鍵詞:大曲酯化種類

    張 健,李 波,程平言,向祖祥,胡 峰

    (貴州茅臺酒廠(集團)習酒有限責任公司,貴州習水564622)

    高溫大曲在醬香白酒釀造過程中起到糖化劑、發(fā)酵劑、增香劑的作用[1],“曲乃酒之骨”,好曲出好酒,優(yōu)質(zhì)高溫曲對白酒的產(chǎn)質(zhì)量有重要的作用。高溫大曲為醬香酒釀造過程的呈香提供了多種香味前體物質(zhì),從而利于醬酒風味的形成。大曲的品質(zhì)與曲房的培養(yǎng)過程密不可分,培養(yǎng)過程中曲坯微生物的種類、數(shù)量以及理化指標是反映曲坯發(fā)酵好壞的關鍵因素。壓制成型的曲坯入曲房后,通過自然接種發(fā)酵、富集曲房環(huán)境中微生物形成了復雜的發(fā)酵微生物菌體系,經(jīng)過30多天的發(fā)酵培養(yǎng),形成了富含菌、酶、物三系[2]的曲塊,繼續(xù)貯存4~6個月制成成品曲,為釀造好酒奠定了基礎。

    傳統(tǒng)人工制曲方式,勞動強度大,生產(chǎn)效率低,人工成本高。隨著白酒行業(yè)機械化的推進,習酒在節(jié)能降耗的背景下,創(chuàng)新高溫制曲工藝,在行業(yè)當前的制曲機的基礎上,提出仿生學原理,最終與四川宜賓岷江機械廠共同合作,成功開發(fā)了仿生機械壓曲機[3],壓制過程和人工踩曲相似。仿生機制曲的應用,能否達到人工曲品質(zhì),滿足生產(chǎn)需求,曲坯的培養(yǎng)發(fā)酵過程至關重要,本研究通過對培養(yǎng)發(fā)酵過程中仿生機制曲曲坯微生物的數(shù)量、種類以及理化指標(水分、酸度、發(fā)酵力、液化力、酯化力、糖化力)進行實驗分析,并與同期培養(yǎng)的傳統(tǒng)曲各相應指標進行對比分析研究,從而發(fā)現(xiàn)它們之間的差異,為仿生機制曲的好壞提供參考,保障仿生機制曲在釀酒中的投產(chǎn)應用效果,通過本研究進一步豐富習酒釀酒機械化研究體系、完善了習酒釀酒微生態(tài)體系。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 曲樣來源

    習酒公司高溫制曲車間同一生產(chǎn)輪次傳統(tǒng)班和機械制曲班的曲樣。

    1.1.2 試劑

    微生物分離培養(yǎng)試劑見(1.1.3);理化檢測試劑參照《白酒生產(chǎn)技術全書》[4]《釀酒大曲通用分析方法》[5]的使用試劑。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    細菌分離培養(yǎng)基:牛肉膏0.3 g,NaCl 0.5 g,蛋白胨1 g,瓊脂粉2 g,pH值7.2~7.4,蒸餾水100 mL,121℃滅菌20 min。

    孟加拉紅培養(yǎng)基(霉菌):蛋白胨0.5 g,葡萄糖1 g,K2HPO40.1 g,MgSO40.05 g,孟加拉紅0.003 g,瓊脂粉2 g,氯霉素0.01 g,pH值7.0~7.4,蒸餾水100 mL,121℃滅菌20 min。

    酵母分離培養(yǎng)基:蛋白胨0.5 g,葡萄糖5 g,酵母浸粉0.5 g,瓊脂粉2 g,青霉素0.01 g,儲備液A4 mL,儲備液B 0.1 mL,儲備液C 0.1 mL,蒸餾水100 mL,pH=6.5,121℃滅菌20min,滅菌后加儲備液C0.1mL。

    儲備液A:K2HPO41.1 g,KCl 1.0 g,CaCl20.3 g,MgSO40.2 g,蒸餾水100 mL。

    儲備液B:FeCl30.25 g,MnSO40.12 g,蒸餾水100 mL。

    儲備液C:0.44 g溴甲酚綠溶于20 mL無水乙醇。

    1.2 儀器設備

    主要設備:電子天平,分析天平,超凈工作臺,標準移液槍,生化恒溫培養(yǎng)箱,電熱恒溫干燥箱,恒溫水浴鍋,秒表,白瓷板,電子萬用爐。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 微生物平板計數(shù)實驗方法

    (1)曲樣的采集方法

    分別采取人工和仿生機制曲曲房第一次翻曲、第二次翻曲、拆曲時的曲樣,樣品保存于無菌密封袋,各取200 g,粉碎混勻,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    (2)曲樣的前處理

    將采集的樣品四分法稱取10 g,加入90 mL無菌0.9%的生理鹽水中,振蕩搖勻,置于恒溫搖床,以適當?shù)乃俣?,培養(yǎng)活化12 h后,取出靜置。進行梯度稀釋得到菌懸液,取各濃度的菌懸液0.1 mL分別涂布在提前滅菌備用的細菌、霉菌、酵母平板上。

    (3)微生物培養(yǎng)分離與計數(shù)

    細菌分離平板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后開始記錄細菌的總數(shù)與種類,酵母分離平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h后記錄總數(shù)與種類。霉菌分離平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)3~7 d觀察記錄總數(shù)與種類。

    根據(jù)仿生機械曲和人工曲不同培養(yǎng)時間曲樣所得微生物種類和數(shù)量進行對比分析,得出兩種曲微生物指標間的異同。

    1.3.2 理化指標的檢測方法

    參照《白酒生產(chǎn)技術全書》[4]《釀酒大曲通用分析方法》[5]。

    (1)水分測定

    稱取10.0 g曲樣于干燥潔凈的稱量皿中,記錄總重量,將其置于溫度為125℃的恒溫干燥箱內(nèi),烘2 h直至恒重,取出放入干燥器中冷卻30 min,稱重,記錄重量,計算大曲水分(水分含量以百分比表示)。

    (2)酸度測定

    稱取約10 g曲樣,置于250 mL三角瓶中,記錄樣品重量,準確加水100 mL,攪勻,在室溫下浸泡15 min。每隔5 min攪拌1次。用雙層紗布或脫脂棉過濾浸提液,棄去初濾液20 mL,用三角瓶接取濾液備用,即為待測液。

    準確吸取10.0 mL待測液于250 mL三角瓶中,加水約20 mL,搖勻,加2滴酚酞作為指示劑,用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至呈微紅色,且30 s不褪色。記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積,根據(jù)消耗體積計算結果(酸度為10 g絕干大曲消耗0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫摩爾數(shù),單位為mmol/10 g)。

    (3)發(fā)酵力測定

    取玉米粉原料50 g,加水250 mL,混勻,蒸煮1~2 h,使呈糊狀,冷卻到60℃。加入原料量15%的大曲粉,再加50 mL 60℃的水攪勻。在60℃下糖化3~4 h,取出1滴與0.1 mol/L碘標準溶液反應直至不顯藍色為止。即為糖化液。

    用移液管吸取糖化液50 mL于250 mL三角瓶內(nèi),用石蠟密封發(fā)酵瓶,無菌條件下加入曲粉1 g,發(fā)酵瓶中加入5 mol/L硫酸溶液10 mL,用石蠟密封發(fā)酵瓶,擦干瓶外壁,在分析天平上稱量,記錄稱量結果,然后放入30℃恒溫箱中發(fā)酵48 h。取出發(fā)酵瓶,輕輕搖動,使二氧化碳全部逸出,在同一條件下稱量,記錄稱量結果,計算發(fā)酵力大?。ㄔ?0℃、48 h內(nèi)0.5 g大曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的二氧化碳克數(shù)為一個發(fā)酵力單位,符號為U,以“g/0.5 g·48 h”表示)。

    (4)酯化力測定

    吸取己酸-乙醇溶液100 mL,于250 mL蒸餾瓶中,加入相當于絕干樣品5 g曲粉,在恒溫箱中35℃酯化100 h,取出后加水50 mL。加熱蒸餾,接出餾出液100 mL,作為酯化力含量的測定液。吸取50 mL餾出液,加入酚酞指示劑3滴,用氫氧化鈉標準溶液中和至微紅色出現(xiàn),準確加入氫氧化鈉標準溶液25 mL,沸水浴中回流30 min,冷卻后用硫酸標準溶液滴定到微紅色消失為終點,計算酯化力(5 g大曲在35℃,經(jīng)過100 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個酯化力單位,符號為U,以“mg/50 g·100 h”表示)。

    (5)糖化力測定

    稱取相當于10 g絕干曲樣品于大燒杯中,根據(jù)測定的曲樣水分查得應加水量,再加入20 mL pH 4.6乙酸-醋酸鈉緩沖液充分攪拌,在35℃水浴中浸泡1 h,用濾紙過濾,濾液備用,于100 mL試管中加3%可溶性淀粉25 mL,置于35℃水浴中保溫15 min,加大曲浸出液5 mL,迅速搖勻計時,并立即吸取5 mL混合液注入盛有斐林甲、乙液各5 mL和20 mL蒸餾水的三角瓶中,剩余的混合液繼續(xù)在35℃水浴中準確糖化1 h,立即吸出5 mL糖化液注入另一盛有斐林甲、乙液各5 mL和20 mL蒸餾水的三角瓶中,定糖(在35℃、pH 4.6條件下,1 g絕干曲1 h轉化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個糖化力單位,符號為U,以“mg/g·h”表示)。

    (6)液化力測定

    稱取相當于10 g絕干曲樣品于大燒杯中,用緩沖液以35℃浸泡30 min,用濾紙過濾,濾液為供試酶液。吸取20 mL 2%可溶性淀粉溶液和5 mL pH 6.0緩沖液溶液于25×100 mL試管中,于水浴中預熱60 min,準確加入5 mL稀釋酶液,立即計時。充分搖勻后,定時用滴管取出約0.5 mL反應液,滴入預先盛有稀碘液的白瓷板中,呈色反應由藍紫色逐漸變?yōu)榧t棕色,直至與標準比色溶液顏色相同為止,即為反應終點,記錄反應時間,計算液化力(在35℃,pH 6條件下,1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個液化力單位,符號為U,以“g/g·h”表示)。

    根據(jù)實驗方法測定仿生機制曲與人工曲培養(yǎng)不同時間的各理化指標數(shù)據(jù),對比分析兩者的差異,得出實驗結論。

    2 結果與分析

    2.1 機制曲與人工曲微生物培養(yǎng)結果與分析(表1)

    表1 人工曲與機制曲的微生物種類對比分析

    通過仿生機制曲與人工曲微生物的分離培養(yǎng)實驗,從表1數(shù)據(jù)分析表明:第一次翻曲時兩者的微生物培養(yǎng)結果細菌的種類最多,有14種,霉菌、酵母的種類較少,兩者主要微生物細菌、酵母的種類基本一致;隨著培養(yǎng)時間的延長,到拆曲出房時,兩者的主要微生物細菌、霉菌、酵母的種類都明顯比第一次翻曲時減少,但細菌種類仍然最多,機制曲8種,人工曲7種,霉菌均為兩種,酵母的種類最少,都只有1種。通過實驗得出:仿生機制曲3個培養(yǎng)時期的主要微生物種類均和人工曲相應培養(yǎng)時期的微生物種類保持基本一致,差異小,因此仿生機制曲微生物種類達到人工曲的標準,采用仿生機制曲不會影響高溫大曲微生物的種類。

    表2 人工曲與仿生機制曲的微生物數(shù)量對比分析

    從表2微生物數(shù)量實驗數(shù)據(jù)對比分析表明:兩者的微生物數(shù)量第一次翻曲時最多,細菌的數(shù)量最多,霉菌、酵母的數(shù)量較少,細菌數(shù)量到達106,霉菌、酵母的數(shù)量為103;隨著培養(yǎng)時間的延長,第二次翻曲時兩者的霉菌數(shù)量增多,達到104,基本相當,拆曲出房時,兩者的主要微生物的數(shù)量都變少,但細菌數(shù)量仍然最多,為105,霉菌為103,酵母為102,酵母最少。通過實驗數(shù)據(jù)分析得出:仿生機制曲3個培養(yǎng)時期的主要微生物數(shù)量均和人工曲相應培養(yǎng)時期的微生物數(shù)量保持一致,說明仿生機制曲微生物數(shù)量達到人工曲微生物的標準,采用仿生機制曲培養(yǎng)過程中微生物的數(shù)量不會受到影響,仿生機制曲生產(chǎn)達到公司高溫大曲微生物的標準。

    通過微生物實驗證明仿生機制曲和人工曲曲房培養(yǎng)過程中3個時間段的微生物種類、數(shù)量都保持一致,說明仿生機制曲不影響高溫大曲的微生物生長。

    2.2 理化指標的結果與分析(表3)

    表3 人工曲與仿生機制曲理化指標對比分析

    表3實驗結果表明:仿生機制曲的3個培養(yǎng)時期的主要理化指標水分、酸度、糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力和人工曲的指標基本保持一致。拆曲出房時人工曲的水分含量為12.7%,酸度0.79 mmol/10 g,糖化力336.45 U,液化力1.29 U,酯化力18.62 U,發(fā)酵力1.62 U;仿生機制曲的水分含量為13.2%,酸度0.67 mmol/10 g,糖化力318.87 U,液化力0.84 U,酯化力20.85 U,發(fā)酵力1.64 U;通過數(shù)據(jù)分析得出,仿生機制曲與人工曲在第一次、第二次翻曲時各理化指標保持一致,而拆曲出房時兩者的各項指標同樣趨于一致,相差不大,仿生機制曲理化指標達到人工曲標準,達到公司標準要求。

    3 討論

    醬香型大曲培養(yǎng)過程中主要微生物細菌、霉菌、酵母的種類與數(shù)量可以直接反映曲房中曲坯的發(fā)酵是否正常,曲坯的發(fā)酵是復合發(fā)酵過程,培養(yǎng)過程中微生物種類越豐富,數(shù)量越多,成品曲積累的各種酶系越豐富,成品曲中微生物的代謝產(chǎn)物越多,為釀酒提供的前體物質(zhì)越多[6]。

    理化指標中水分、酸度、液化力和糖化力反映醬香型大曲是否成熟;發(fā)酵力和酯化力是醬香型大曲的生化性能,反映了醬香型大曲品質(zhì)。通過對比分析仿生機制曲與人工曲培養(yǎng)發(fā)酵過程中3個時期的各項理化指標,可以提前預判最終成品曲的品質(zhì),因此通過微生物指標、理化指標的分析對比可知,仿生機制曲與人工曲存在品質(zhì)差異[7]。

    從實驗結果可以推斷,第一,仿生機制曲和人工曲在發(fā)酵培養(yǎng)的各階段微生物種類和數(shù)量基本一致,表明仿生機制曲不會影響高溫大曲的微生物種類和數(shù)量;第二,通過對理化指標的實驗測定,結果表明兩者各樣品的理化指標雖有差異,但總體比較接近,且最終拆曲出房時所有理化指標數(shù)值大小均在企業(yè)標準范圍內(nèi),符合醬香型大曲的理化指標符合地方標準DB 52/T871中的規(guī)定。

    本研究表明,仿生機械制曲能夠達到人工曲微生物指標、理化指標要求,對高溫大曲的品質(zhì)沒有不利影響。

    為了加快白酒行業(yè)兩化融合,推進白酒行業(yè)機械化進程,習酒仿生機制曲的開發(fā)成功地為同行提供了技術參考。仿生機制曲能夠達到人工曲質(zhì)量標準,符合醬香型白酒的生產(chǎn)需要,同時也能節(jié)能降耗,節(jié)約成本,提高工作效率。

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