外泌體來源microRNA與心肌梗死的關(guān)系

石虎偉，韓志君，楊承健

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)的多囊泡小體或胞芽與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外的小囊泡[1]。外泌體中含有細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA（miRNA）和lncRNA等大分子物質(zhì)[2]，并可將這些物質(zhì)傳遞到鄰近或遠(yuǎn)距離的靶細(xì)胞，從而發(fā)揮作用。在血液、尿液、膽汁、唾液等體液中都可發(fā)現(xiàn)外泌體[3-6]。不同細(xì)胞來源的外泌體含有相關(guān)特征的蛋白質(zhì)，例如腸上皮細(xì)胞分泌的外泌體中含有代謝酶，免疫細(xì)胞分泌的外泌體中含有與抗原提呈相關(guān)的蛋白質(zhì)，主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類及Ⅱ類分子[7]。

成熟的miRNA大約由22個(gè)核苷酸組成，通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTRs）特異性結(jié)合，促進(jìn)靶mRNA的降解或者抑制其翻譯。miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控并非專一，研究顯示一個(gè)miRNA能夠調(diào)控多個(gè)不同的mRNA，而一個(gè)mRNA亦可同時(shí)被多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在組織中呈特異性分布，如miRNA-208（miR-208）僅在心肌中表達(dá)，且不受其他損傷的干擾[3]。已經(jīng)證實(shí)與心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)的miRNA有miR-1、miR-126、miR-133a、miR-299、miR-499、miR-208等[9]，還有大量調(diào)控蛋白及靶基因的miRNA需要深入的研究探討。

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂或糜爛，伴有不同程度的表面血栓形成、血管痙攣以及遠(yuǎn)端血管栓塞導(dǎo)致的急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。心肌梗死后，外周血中外泌體來源的miRNA大量增加，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。

1 外泌體來源miRNA與心肌梗死的早期診斷

檢測(cè)外周血中外泌體的水平顯示，在合并有心血管危險(xiǎn)因素或罹患心血管疾病的患者中升高。外泌體在形成期間，裝備有來自其親本細(xì)胞的表面分子，及選擇的胞質(zhì)內(nèi)含物（miRNA）。因此外泌體數(shù)量和成分有望成為心肌梗死特異性標(biāo)志物。心肌細(xì)胞分泌的外泌體中含有肌節(jié)蛋白、線粒體蛋白、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和熱休克蛋白-20等[11]。外泌體中的蛋白組成取決于細(xì)胞的功能狀態(tài)，不同程度的應(yīng)激狀態(tài)，其分泌的外泌體中蛋白質(zhì)也不同[12,13]。外泌體的蛋白組成不僅反映其細(xì)胞來源，也反映該細(xì)胞的狀態(tài)[14]，可作為某些疾病的診斷標(biāo)志物。miR-133a原位雜交表明，在急性梗死心肌和梗死周邊心肌含量均很低；心肌細(xì)胞在鈣離子濃度升高后會(huì)釋放包含miRNA的外泌體。將鈣離子載體A23187加入培養(yǎng)基中刺激H9c2心肌細(xì)胞，然后測(cè)定培養(yǎng)基外泌體中miR-133a濃度，顯示鈣離子載體A23187誘導(dǎo)miR-133a呈劑量依賴性釋放。這些結(jié)果提示，心血管疾病患者血液中miR-133a水平升高主要來源于損傷心肌。循環(huán)miR-133a可作為心肌細(xì)胞損傷的早期診斷標(biāo)志物[15]。另外，有研究表明，外泌體內(nèi)與P53基因相關(guān)的多種miRNA（miR-92、miR-194以及miR-34a）在急性心肌梗死后心力衰竭的早期階段明顯上升[16]。外泌體來源的miR-1、miR-208a在急性心肌梗死患者的尿液及大鼠模型的血液中升高[17]。因此，這些外泌體來源的miRNA亦有望成為心肌梗死早期診斷標(biāo)志物。

2 外泌體來源的miRNA在心肌梗死中的保護(hù)作用

心臟分泌的外泌體既可以調(diào)節(jié)心肌修復(fù)，也可以遠(yuǎn)距離傳遞生物信息，發(fā)揮作用的可能是內(nèi)容物miRNA和蛋白質(zhì)。Kuwabara等[15]研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病患者升高的miR-133a來源于損傷的心肌。循環(huán)中的miR-133a可以作為心肌損傷的標(biāo)志物。在心肌梗死區(qū)和梗死周邊區(qū)，心肌細(xì)胞會(huì)分泌外泌體，外泌體中含有特異性miR-133a和miR-1，從而血清中miRNA顯著增多，促進(jìn)血管生成，調(diào)節(jié)心肌修復(fù)，此外外泌體來源miR-126、miR-130可以發(fā)生類似作用[18,19]。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示上調(diào)外泌體來源miR-1可以增強(qiáng)基底膜內(nèi)的血管和膠原基質(zhì)形成，并增加人源性心肌祖細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。通過Western blot、熒光定量PCR、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-1直接抑制Sprouty相關(guān)spred1基因，敲除spred1基因?qū)?huì)上調(diào)miR-1促進(jìn)血管生成。利用系統(tǒng)生物學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)在人源性心肌祖細(xì)胞，miR-1調(diào)控血管生成有關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)，包括spred1通路。上調(diào)miR-1可以提高人源性心肌祖細(xì)胞血管分化，促進(jìn)血管新生[20]。研究人員對(duì)大鼠和豬通過缺血/再灌注誘導(dǎo)急性心肌梗死模型，向冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注心源性細(xì)胞外泌體（CDCexo），并且以惰性成纖維細(xì)胞外泌體（Fbexo）作為陰性對(duì)照，2 d后，對(duì)梗死面積進(jìn)行量化，從心臟組織或骨髓中分離巨噬細(xì)胞進(jìn)行下游分析，使用RNA測(cè)序來檢測(cè)巨噬細(xì)胞（MΦ）中的外泌體含量和基因表達(dá)譜的變化，再灌注后，CDCexo（而不是Fbexo）的輸注降低了大鼠和豬心肌梗死面積。此外，CDCexo會(huì)減少梗死組織內(nèi)CD68陽性的巨噬細(xì)胞數(shù)量，并改變巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，這類似于心源性細(xì)胞（CDCs）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的作用。相對(duì)于Fbexo，CDCexo內(nèi)富集了幾種miRNA（包括miR-146a、miR-181b和miR-126）。對(duì)CDCexo誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的反向通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-181b在CDC引起的巨噬細(xì)胞極化過程中的變化顯著，而且蛋白激酶Cδ（PKCδ）是該miRNA的下游靶點(diǎn)。另外，為惰性Fbexo選擇性地包裹miR-181b后，也能改變巨噬細(xì)胞表型，并在心肌梗死大鼠中發(fā)揮心臟保護(hù)作用。研究數(shù)據(jù)顯示miR-181b從CDCs到巨噬細(xì)胞的外源轉(zhuǎn)移降低PKCδ轉(zhuǎn)錄水平，這是再灌注后CDCs的心臟保護(hù)作用的分子基礎(chǔ)[21]。研究表明，來自心肌內(nèi)注射誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞釋放的外泌體可以向心肌細(xì)胞傳遞保護(hù)性miR-21及miR-210，減輕心肌缺血/再灌注損傷[22]。

3 外泌體來源miRNA與細(xì)胞移植治療心肌梗死

細(xì)胞療法是將胚胎干細(xì)胞、心肌祖細(xì)胞、CD34+細(xì)胞群等具有分化能力的細(xì)胞通過冠狀動(dòng)脈注射或心肌穿刺等方法注入到心肌中，替代損傷的心肌，甚至分化成為具有收縮功能的心肌細(xì)胞，減小梗死面積，促進(jìn)血管新生，改善心臟功能[23]。有研究介紹了在缺血性心臟病中，基因與細(xì)胞治療聯(lián)合能顯著改善移植細(xì)胞的存活，其中外泌體來源miRNA的轉(zhuǎn)移起重要作用。盡管干細(xì)胞治療心肌梗死能夠顯著改善心功能，但一直面臨移植細(xì)胞存活率低的問題。低氧誘導(dǎo)因子1（HIF1）能夠介導(dǎo)缺血的適應(yīng)反應(yīng)，心肌梗死后6周，CPCs+MC-HIF1處理組的射血分?jǐn)?shù)最高，其次是MC-HIF1處理組，CPCs+MC-GFP處理組。心臟內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能被心臟祖細(xì)胞（CPCs）獲取。過表達(dá)HIF1的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中miR-126和miR-210的水平較高。這些miRNA在受體CPC中激活，誘導(dǎo)糖酵解轉(zhuǎn)化，提高對(duì)低氧的耐受性。抑制此類miRNA削弱外泌體保護(hù)作用。提示，HIF1能夠調(diào)節(jié)微環(huán)境，從而提高移植細(xì)胞的存活。外泌體中的miRNA從宿主細(xì)胞到移植細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提示了一個(gè)潛在的靶點(diǎn)來改善移植細(xì)胞的存活率[24]。有研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死后miR-150在骨髓單核細(xì)胞的表達(dá)量下降，從而引起蛋白CXCR4的表達(dá)量升高，誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞遷移到受損心肌處，改善心肌[25]。來自英國(guó)的研究人員使用主動(dòng)脈瓣手術(shù)得到的心包液發(fā)現(xiàn)，與外周血漿相比，心包液富含在患者心肌和血管系統(tǒng)中表達(dá)的miRNA的外泌體。這些外泌體轉(zhuǎn)移let-7b-5p到內(nèi)皮細(xì)胞（EC），從而減少TGFBR1表達(dá)，改善EC的存活、增殖和成血管，總之，心包液富含心臟分泌的miRNA，并通過外泌體傳遞這些miRNA介導(dǎo)血管反應(yīng)，協(xié)調(diào)血管修復(fù)[26,27]。Nguyen等用骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分泌的有生物活性的細(xì)胞因子、外泌體注射到梗死心臟，提高心肌梗死后新生血管的形成、促進(jìn)心肌細(xì)胞存活、降低心臟纖維化[28]。例如胚胎干細(xì)胞源外泌體可向受體CPCs傳遞miR-294，促進(jìn)心臟祖細(xì)胞的存活及增殖[29]。移植的干細(xì)胞可以釋放含有miR-1、miR-126的外泌體，Spred1蛋白可以抑制血管再生，外泌體來源的miR-1、miR-126可以降低Spred1蛋白的表達(dá)量，從而促進(jìn)血管新生[19]。此外Barile等研究顯示心臟祖細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)miR-210及miR-132高表達(dá)，且miR-210通過抑制其目標(biāo)基因ephrinA3及 PTP1b減少心肌細(xì)胞凋亡，miR-132可下調(diào)目標(biāo)基因 RasGAP-pl20表達(dá)，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力[30]。

4 展望

外泌體因?yàn)榧?xì)胞來源的不同蛋白質(zhì)和miRNA組成亦不同[12,13]，且易通過流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量PCR被快速獲取[31,32]。這些生物特性為外泌體的體外研究、臨床應(yīng)用提供了可能。其中外泌體來源的miRNA在心肌梗死的早期診斷、心肌保護(hù)及移植治療方面均有重要作用，相信通過更多深入的研究，外泌體來源miRNA在心肌梗死后的心肌修復(fù)會(huì)應(yīng)用于臨床治療，造?；颊?。