在陰莖勃起中一氧化氮合酶的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展

高 軻 陳康寧 李榮欣 綜述 董治龍 審校

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所，甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心（蘭州 730030）

陰莖勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指陰莖不能達(dá)到和（或）維持足夠的勃起以獲得滿意的性生活，并且時(shí)間持續(xù)3個(gè)月以上者[1]，已逐漸成為困擾全球男性的重要疾病之一。近年來，對(duì)陰莖勃起的基礎(chǔ)研究取得了很大的突破，其中一氧化氮-環(huán)鳥苷磷酸（NO/cGMP）通路是目前與陰莖勃起相關(guān)最為經(jīng)典、研究最為深入的分子信號(hào)通路，以NO/cGMP通路調(diào)控作用為基礎(chǔ)的5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5，PDE5）抑制劑藥物治療ED已經(jīng)應(yīng)用到臨床并且取得了很好的療效。然而，盡管在這一領(lǐng)域的相關(guān)研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但是充分的認(rèn)識(shí)和理解一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）在勃起功能的生理狀態(tài)和病理狀態(tài)的作用及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制仍然具有一定的意義，即在探索這些機(jī)制的過程中，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)，并將之充分的利用到臨床，達(dá)到治療的目的，為廣大男性ED患者帶來更加多元的治療手段?，F(xiàn)將NO及NOS在勃起功能中的作用和相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制做一綜述，為進(jìn)一步的研究闡明理論基礎(chǔ)。

一、NO與陰莖勃起

一氧化氮（NO）作為一種短壽命的自由基氣體，可以在人體內(nèi)立即產(chǎn)生，具有高反應(yīng)性和自由擴(kuò)散跨細(xì)胞膜的特點(diǎn)，因此在人體的的心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等各種生物過程中起到了很重要的作用如細(xì)胞毒素劑、神經(jīng)傳遞素和血管擴(kuò)張劑[2,3]。勃起功能是一個(gè)復(fù)雜過程，血管、神經(jīng)和內(nèi)分泌之間的相互作用會(huì)促進(jìn)血管的舒張或者降低陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞的收縮性而導(dǎo)致陰莖的勃起[4]。在陰莖勃起的過程中，NO作為一種主要的氣體信使分子，介導(dǎo)了陰莖血管和海綿體平滑肌的松弛，起到了關(guān)鍵性的作用[5]。人體內(nèi)NO在陰莖中的產(chǎn)生過程與在其他器官中類似，涉及NOS的催化作用。NOS在氧氣（O2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）存在的條件下催化L-精氨酸（L-arginine）產(chǎn)生 L- 胍氨酸（L-citrulline）和 NO[6]。NO是一種高度親脂性氣體，能夠自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入到平滑肌細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）結(jié)合，使后者激活，GTP從而轉(zhuǎn)化為第二信使cGMP， 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP表達(dá)增加，cGMP能夠通過相關(guān)蛋白的磷酸化、酶、離子通道使海綿體平滑肌和血管舒張，引起勃起發(fā)生[7]。相關(guān)的報(bào)道指出[7,8]，cGMP引起平滑肌舒張的主要機(jī)制有兩種途徑：一種途徑是降低鈣離子濃度，使鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合體誘導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase, MLCK）活性喪失；另一種途徑是抑制RhoA活性及在肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase, MLCP）水平對(duì)抗Rho蛋白激酶對(duì)MLCP的抑制作用，促進(jìn)鈣脫敏；這兩種途徑最終都會(huì)使肌球蛋白輕鏈（myosin light chain, MLC）發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致海綿體平滑肌和血管舒張。陰經(jīng)勃起相關(guān)的分子信號(hào)通路除了上文所提到的最經(jīng)典的NO/cGMP通路，還有cAMP通路、CO通路、H2S通路等[9]，這些通路是相互聯(lián)系，相互作用，共同影響勃起功能。在探索這些小分子信號(hào)通路以及這些通路在陰莖勃起的生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下的相關(guān)機(jī)制，也許能夠發(fā)現(xiàn)新方法來治療威脅男性勃起功能健康狀況的相關(guān)疾病，并且能為勃起功能障礙的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

二、NOS調(diào)節(jié)機(jī)制

在共同底物如O2和 NADPH以及輔酶因子如核黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD），黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN），四氫生物喋呤（5,6,7,8-tetrahydroL-biopterin，BH4）等的參與下，NO是由三種異構(gòu)體的NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生的[10]，這三種異構(gòu)體分別為神經(jīng)型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS），其基因分別定位于12、7和17號(hào)染色體上；從功能上又可分為組成型（cNOS，包括 nNOS 和 eNOS）及誘導(dǎo)型（iNOS）兩種[6]。NOS是由兩個(gè)相同亞基組成的二聚體，每個(gè)NOS亞基有三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：還原酶結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和加氧酶結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有不同的作用，其亞型主要存在于不同的細(xì)胞，具有不同的結(jié)構(gòu)和功能[11]。nNOS主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，在陰莖中分布于盆腔和海綿體神經(jīng)及其分支上；eNOS主要位于內(nèi)皮細(xì)胞中，在陰莖中分布于動(dòng)脈、海綿體內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌上，和nNOS具有相似的調(diào)節(jié)機(jī)制即細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高可以激活這兩種亞型；iNOS主要存在于單核細(xì)胞中,具有鈣依賴性，很少在正常情況下表達(dá)，主要作用于免疫系統(tǒng)[4,12,13]。

cNOS錨定在內(nèi)皮細(xì)胞膜的內(nèi)表面，通過內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞活化，來維持血壓和血流量，白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用和神經(jīng)元間的信號(hào)傳遞等生理環(huán)境的穩(wěn)定[11]，其調(diào)節(jié)主要是依賴鈣離子以及鈣與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，其他的一些相關(guān)機(jī)制有蛋白與蛋白之間的相互作用如熱休克蛋白、小窩蛋白、硝基化作用、磷酸化作用和乙?；饔玫萚4,14]。例如eNOS的活化就是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要為胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，在熱休克蛋白90的參與下，促進(jìn)eNOS二聚化，并且相關(guān)的激酶磷酸酶聚集進(jìn)一步活化eNOS[15,16]。iNOS主要在一些比如內(nèi)源性細(xì)胞因子、細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖等炎性刺激的作用下產(chǎn)生，從而能夠促進(jìn)NO持續(xù)大量產(chǎn)生，具體的作用機(jī)制還需深入研究[17]。NOS是促進(jìn)NO合成的關(guān)鍵酶，弄清楚NOS的調(diào)節(jié)機(jī)制，不僅對(duì)于理解NOS調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生具有重要的意義，而且能夠發(fā)現(xiàn)影響陰莖勃起的相關(guān)因素，為探索陰莖勃起功能障礙的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

三、NOS磷酸化的作用

磷酸化和去磷酸化組成了NOS生物活性中的一個(gè)主要調(diào)節(jié)機(jī)制。eNOS有多個(gè)磷酸化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)，絲氨酸1177、635和617號(hào)位點(diǎn)，其磷酸化促進(jìn)酶的活性；而絲氨酸116、蘇氨酸495號(hào)位點(diǎn)的磷酸化抑制酶的活性[3]。在nNOS的絲氨酸殘基中代表關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)的是絲氨酸1412、847、741號(hào)，第一個(gè)是有促進(jìn)作用的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，后兩個(gè)是有抑制作用的調(diào)節(jié)位點(diǎn)[18,19]。目前已知催化磷酸化的一些特殊蛋白激酶有激酶Akt（蛋白激酶B）、環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶（protein kinase A，PKA）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）、環(huán)鳥苷酸依賴性蛋白激酶和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaM激酶Ⅱ）[11,18]。許多不同的胞外刺激物直接激活蛋白激酶，從而導(dǎo)致NOS的激活，例如，血流剪切應(yīng)力誘發(fā)eNOS在絲氨酸1177位點(diǎn)磷酸化是通過PKA，在相同位點(diǎn)，內(nèi)皮生長因子依賴性磷酸化是通過Akt的調(diào)節(jié)[11]；谷氨酸的刺激影響nNOS的催化作用，其中，促進(jìn)作用是通過Akt介導(dǎo)的絲氨酸1412號(hào)位點(diǎn)的磷酸化，抑制作用是通過CaM激酶Ⅱ介導(dǎo)的絲氨酸847號(hào)位點(diǎn)的磷酸化[18]。使NOS去磷酸化的蛋白磷酸酯酶如絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酯酶1、絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酯酶2A和鈣依賴磷酸酶的作用也起到促進(jìn)或抑制依靠酶特殊功能位點(diǎn)的酶的活性。對(duì)NOS的活性上的調(diào)節(jié)影響，不同激酶和磷酸酯酶的相對(duì)貢獻(xiàn)和相互作用，我們依然要有充分的認(rèn)識(shí)。

有相關(guān)的研究顯示，NOS的磷酸化作用在氧化還原信號(hào)機(jī)制中能促進(jìn)活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生而發(fā)揮作用[20]。也有報(bào)道表明，在大鼠陰莖海綿體組織中，雄激素可以通過上調(diào)相關(guān)的蛋白，磷酸化eNOS后激活eNOS，促進(jìn)內(nèi)源性 NO生成和釋放，從而促進(jìn)大鼠陰莖海綿體的勃起。然而，確切的機(jī)制還不清楚[21]。由此可以看出，磷酸化和去磷酸化是NOS活性的調(diào)控機(jī)制的一個(gè)重要組成部分，有助于理解陰莖勃起的生理過程，為臨床應(yīng)用提供新的方法，然而目前相關(guān)的機(jī)制還不明確，NOS磷酸化和去磷酸化在陰莖勃起與勃起功能障礙的具體作用還需深入的研究。

四、NOS巰基亞硝基化的作用

亞硝基化和去亞硝基化作為一個(gè)普遍存在的生物化學(xué)機(jī)制，構(gòu)成了NOS酶類活性的一個(gè)重要調(diào)節(jié)機(jī)制，其中亞硝基化導(dǎo)致酶類活性抑制，而去亞硝基化增加酶類的活性。亞硝基化作用是一種可逆性的蛋白質(zhì)巰基氧化修飾方式，通過該方式形成的亞硝基硫醇（S-nitrosothiols） 在調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、細(xì)胞定位、蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用中具有重要的意義，從而使NO 的生物活性廣泛發(fā)揮[22]。因此，在NO生物特性的研究中，一個(gè)新興的觀點(diǎn)是第二信使亞硝基硫醇在細(xì)胞的NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要的調(diào)節(jié)作用，是NO 發(fā)揮廣泛生物活性的主要分子機(jī)制之一。在亞硝基硫醇功能調(diào)節(jié)中，關(guān)鍵的酶就是亞硝基谷胱甘肽還原酶，在陰莖的神經(jīng)和血管中都存在，它能夠使亞硝基谷胱甘肽代謝，間接地降低亞硝基化的蛋白質(zhì)水平，從而可能會(huì)影響細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)[23]。巰基亞硝基化（snitrosylation，SNO）作用可以調(diào)節(jié)NO的多種生物作用如離子通道活性、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡機(jī)制、抗炎癥反應(yīng)等，而且有許多因素參與了調(diào)節(jié)巰基亞硝基化作用，例如α腫瘤壞死因子，氧化的低密度脂蛋白等降低蛋白巰基亞硝基化；剪切應(yīng)力，嚴(yán)重缺氧增加巰基亞硝基化作用[24]。相關(guān)的文獻(xiàn)指出，SNO通過抑制可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase)、eNOS本身以及eNOS調(diào)節(jié)蛋白（熱休克蛋白90、Akt等）來負(fù)性調(diào)節(jié)NOS[4]。SNO相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生異常，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，從而會(huì)大大增加疾病的病理生理狀態(tài)，而且由于NO調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜性，對(duì)SNO的研究還有很多方面有待深入， 如蛋白質(zhì)的亞硝基化/去亞硝基化/轉(zhuǎn)硝基化的分子反應(yīng)機(jī)制、SNO作用位點(diǎn)選擇性、催化機(jī)制、調(diào)節(jié)機(jī)制等[25]。

NOS的亞硝基化和去亞硝基化在陰莖生理性勃起中有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，但是其與陰莖勃起的病理狀態(tài)之間的聯(lián)系還未確定。NOS亞型與SNO之間關(guān)系將會(huì)進(jìn)一步豐富陰莖勃起功能的相關(guān)知識(shí)，對(duì)于揭示多種陰莖勃起功能障礙的特殊機(jī)制以及探索新的治療方法有一定的幫助。

五、總結(jié)

毫無疑問，NO在陰莖勃起的生理和病理狀態(tài)中有著重要的作用，是陰莖勃起的主要媒介物，它在陰莖中有著自我平衡的作用，而NOS作為NO合成的關(guān)鍵酶，涉及了nNOS 和eNOS 在陰莖中各自功能的改變。PDE5抑制劑是以NO信號(hào)通路上的一個(gè)小分子位點(diǎn)為目標(biāo)來治療勃起功能障礙，并且已經(jīng)取得成功。但在陰莖勃起的生理和病理狀態(tài)下充分地描述NOS的調(diào)節(jié)機(jī)制仍是必需的，以便能夠充分地探討NO的生物特性而達(dá)到臨床治療的目的?？偟膩碚f，NOS翻譯后的修飾（如磷酸化、S-亞硝基化）是NOS調(diào)節(jié)中的一個(gè)重要的決定性因素，并且相關(guān)的研究已經(jīng)開始探討在陰莖勃起功能中NOS調(diào)節(jié)機(jī)制的相互關(guān)系，為理解勃起功能及勃起功能障礙提供更好的理論基礎(chǔ)，也為勃起功能障礙在臨床的治療中提供新的靶點(diǎn)，找到新的方法。

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