實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

□ 李秋陽 姚 瑤 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局

在PCR指數(shù)擴(kuò)增過程中，借助強(qiáng)弱不同的連續(xù)監(jiān)測熒光信號(hào)及時(shí)測定異性產(chǎn)物量，將此作為依據(jù)，測出目的基因拷貝數(shù)。定量PCR技術(shù)從產(chǎn)生開始至逐步完善，不再是最初的單一染料法，演變成特異性比較高的Fret、Taq man等探針法，隨著Taq man探針廣泛使用，這種方法也被稱為實(shí)時(shí)定量PCR的方法。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基本原理

PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)越來越多，反應(yīng)中生成的DNA拷貝數(shù)呈指數(shù)級增長，且逐步轉(zhuǎn)入平臺(tái)期，在此期間，實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)檢測整體PCR反應(yīng)流程，不斷分析及擴(kuò)增有關(guān)熒光信號(hào)，緊隨反應(yīng)動(dòng)態(tài)測出熒光信號(hào)變化，通過電腦自動(dòng)繪制成一條曲線，以檢測指數(shù)期特定點(diǎn)PCR產(chǎn)物量，經(jīng)過推斷，得出模板最初含量[1]。熒光閾值將PCR反應(yīng)開始前循環(huán)熒光信號(hào)前15個(gè)用作熒光本底信號(hào)，通常超過熒光閾值檢測到的熒光信號(hào)是一個(gè)值得信賴的信號(hào)，將其作為定義樣本Ct值，也就是在PCR循環(huán)時(shí)，各反應(yīng)管中熒光信號(hào)至指定閾值過程中需要經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。從研究情況看，各模板Ct值和該模板起始拷貝數(shù)是一種線性的關(guān)系，具體來說是一種對數(shù)線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)與Ct值呈反比。根據(jù)已經(jīng)得知的起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品便能繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以，僅需要得到未知樣品Ct值，便能算出樣品的起始拷貝數(shù)。

2 食品檢驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

全球范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因作物種植面積越來越大。經(jīng)過批準(zhǔn)可用作加工原料的轉(zhuǎn)基因作物有玉米、大豆等。轉(zhuǎn)基因食品在給人們帶來經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也讓食品營養(yǎng)更多樣。而轉(zhuǎn)基因作物存在一定的環(huán)境及生態(tài)問題，經(jīng)過加工制成的食品，對人類健康的影響受到人們關(guān)注。甲基化檢測與SNP檢測等基因分型：Realtime PCR一般使用兩種方式，一種是探針法（Taq man probe），另外一種是熒光染料摻入法（Sybr green），在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR熒光染料，當(dāng)該染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈時(shí)，就會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，沒有摻入鏈中的SYBR染料則不發(fā)射任何的熒光信號(hào)?；虮磉_(dá)差異分析：如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理），特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。轉(zhuǎn)基因食品不斷增多，需要強(qiáng)化監(jiān)測及控制工作。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測包括下述三點(diǎn)：

（1）明確是否是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，是否需要進(jìn)行定性檢測；（2）經(jīng)過鑒定，確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系；（3）監(jiān)測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量[2]。

RQ-PCR技術(shù)的應(yīng)用，較好地滿足了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的需求。RQ-PCR技術(shù)普遍應(yīng)用在多種農(nóng)作物檢測當(dāng)中，如轉(zhuǎn)基因玉米、大豆等，當(dāng)前轉(zhuǎn)基因作物中具有獨(dú)特的啟動(dòng)子35S、耐除草劑基因EPSPS，用于確定是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食物加工過程中外源DNA污染定量中的應(yīng)用

（1）檢測摻假量。因?yàn)橄啾鹊鞍踪|(zhì)，DNA的熱穩(wěn)定性更高，和免疫學(xué)檢測技術(shù)相比，PCR技術(shù)應(yīng)用過程中，無須借助特異性抗體。相比特異性抗體的合成時(shí)間，它的制備時(shí)間更久，因此，RQ-PCR技術(shù)在食品摻假量檢測方面是一種不錯(cuò)的選擇。SandbergM等人把RQ-PCR技術(shù)用于谷物基因定量檢測當(dāng)中，也將缺乏麥麩嬰兒食物控制在有效范圍。

（2）檢測病原微生物。人們十分注重食源性微生物的檢測。應(yīng)用PCR技術(shù)能更好地測出病原體。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，由于受到污染會(huì)發(fā)生假陽性，所以普通PCR并不用作標(biāo)準(zhǔn)。RQ-PCR靈敏度較高，被推廣應(yīng)用于食源性微生物檢測當(dāng)中，同時(shí)，能夠定量測定致病菌污染程度。如葡萄中一般存在曲霉菌污染，有一定的毒性，Mule G等人將RQ-PCR技術(shù)用于測定葡萄中曲霉菌污染程度。通過此項(xiàng)技術(shù)還能夠測出朊蛋白基因種特異性DNA序列，這是其他一些技術(shù)不能做到的。

3 結(jié)束語

PCR技術(shù)能夠短時(shí)間擴(kuò)增各期單的DNA片斷，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要價(jià)值。傳統(tǒng)的PCR容易遭受污染，不能正確定量，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有較好的特異性、靈敏度，能夠快速反應(yīng)。RTQ-PCR技術(shù)逐步優(yōu)化，它為食品行業(yè)提供了重要的檢測工具。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，未來實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將更加成熟，能夠較好保證食品檢驗(yàn)的科學(xué)性及準(zhǔn)確性。

[1]吳永彬,肖維威,馬文麗.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2011,22(4):575-579.

[2]沈赟.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,17(4):85-86.