肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測在涂陰肺結(jié)核早期診斷中的應(yīng)用價值

鐘劍峰 童涌 童照威 宋群 王偉洪

近年來隨著社會老齡化以及免疫抑制劑的過度使用，結(jié)核病發(fā)病有增多趨勢[1]。根據(jù)2015年中國傳染病網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)，報告肺結(jié)核患者86.4萬例；其中痰涂片陰性（涂陰）患者62萬例，占總發(fā)病數(shù)的71.8%[2]。近年來，隨著結(jié)核桿菌利福平耐藥基因（Xpert MTB/RIF）檢測技術(shù)的應(yīng)用，痰涂片陽性（涂陽）及利福平耐藥肺結(jié)核的早期診斷與治療水平有了很大的提高，但多數(shù)涂陰肺結(jié)核患者仍不能得到及時的診斷與治療[3-4]。因此，提高及時診斷與治療涂陰肺結(jié)核患者的水平，對有效控制結(jié)核病有著舉足輕重的作用。大部分涂陰肺結(jié)核患者的臨床癥狀不明顯，痰量少，所以無法獲得合格的痰標(biāo)本，而通過支氣管鏡留取肺泡灌洗液進(jìn)行檢測是一個很好的方法。本文通過對涂陰肺結(jié)核患者進(jìn)行氣管鏡檢查，留取肺泡灌洗液進(jìn)行抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養(yǎng)及藥敏試驗、Xpert MTB/RIF檢測，以探討肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測在涂陰肺結(jié)核早期診斷中的應(yīng)用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年7月至2016年6月本院收住的213例患者為研究對象，所有患者3次痰找抗酸桿菌（即時痰、夜間痰、晨痰）均為陰性。均行支氣管鏡檢查，最終診斷為涂陰肺結(jié)核［參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008版）》涂陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)］157例為觀察組；經(jīng)進(jìn)一步氣管鏡、肺穿刺活檢及診斷性抗炎治療等隨訪觀察排除結(jié)核病的56例患者為對照組。觀察組中男 97 例，女 60 例；年齡 17～80（51.7±4.6）歲。對照組中男 37 例，女 19 例；年齡 28～82（49.3±3.7）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者簽署支氣管鏡檢查知情同意書，行支氣管鏡采集標(biāo)本前均未予抗結(jié)核治療。

1.2 儀器和試劑 抗酸桿菌涂片染色液（4×250ml，批號：YZB/粵珠0063-2013）購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)（型號：BACTEC MGIT 960）及其配套試劑（批號：YZB/USA 0069-2015）均購自美國BD公司；Xpert MTB/RIF檢測設(shè)備（型號：GeneXpert MTB/RIF）及其試劑盒（批號：YZB/SWE 0773-2014）購自美國Cepheid公司。

1.3 檢查方法 所有患者行支氣管鏡檢查后收集肺泡灌洗液3份（5ml/份），分別行抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養(yǎng)與Xpert MTB/RIF檢測，若液體培養(yǎng)陽性則進(jìn)一步行藥敏試驗。（1）抗酸染色涂片法：肺泡灌洗液標(biāo)本離心濃縮，參照《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》進(jìn)行操作[5]。（2）分枝桿菌液體培養(yǎng)法：應(yīng)用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏系統(tǒng)進(jìn)行分枝桿菌的快速培養(yǎng)與藥敏鑒定。（3）Xpert MTB/RIF檢測法：按照Xpert MTB/RIF設(shè)備說明書進(jìn)行操作，將采集到的肺泡灌洗液標(biāo)本抽取1ml與含有氫氧化鈉及異丙醇的處理液2ml混合，震蕩30s，室溫靜置15min，使生物危險度下降；再吸取2ml處理后的標(biāo)本移至一次性多室反應(yīng)盒中，將反應(yīng)盒置入檢測模塊，約2h讀取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果比較 觀察組肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測陽性率為73.9%（116/157），明顯高于對照組的1.8%（1/56），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 觀察組抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養(yǎng)及Xpert MTB/RIF檢測陽性率比較 觀察組中，肺泡灌洗液抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養(yǎng)及Xpert MTB/RIF檢測陽性率分別為 20.4%（32/157）、38.9%（61/157）和 73.9%（116/157），其中抗酸染色涂片陽性的32例患者分枝桿菌液體培養(yǎng)均為陽性，分枝桿菌液體培養(yǎng)陽性的61例患者Xpert MTB/RIF檢測均為陽性。以上3種方法陽性率經(jīng)兩兩比較，XpertMTB/RIF檢測法＞分枝桿菌液體培養(yǎng)法＞抗酸染色涂片法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Xpert MTB/RIF檢測陽性而分枝桿菌液體培養(yǎng)陰性的55例患者中，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果均為低含量或極低含量。

2.3 Xpert MTB/RIF檢測診斷利福平耐藥的效能 觀察組中分枝桿菌液體培養(yǎng)陽性的61例患者經(jīng)Xpert MTB/RIF檢測均為陽性，對這61例患者進(jìn)行藥敏試驗，鑒定對利福平的耐藥性。以分枝桿菌液體培養(yǎng)藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，液體培養(yǎng)藥敏鑒定利福平耐藥10例；而Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥11例，其中液體培養(yǎng)耐藥的10例患者均被檢出。Xpert MTB/RIF檢測診斷利福平耐藥的靈敏度為100.0%（10/10），特異度為98.0%（50/51），與分枝桿菌液體培養(yǎng)的一致性較好。

3 討論

目前確診結(jié)核病的方法主要為抗酸染色涂片和分枝桿菌液體培養(yǎng)?？顾崛旧科ň哂锌焖?、簡單的特點(diǎn)，但無法區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌，同時對標(biāo)本的菌量要求高，一般標(biāo)本中結(jié)核菌數(shù)量≥10 000個/ml可檢出陽性；分枝桿菌液體培養(yǎng)法能提高一定的陽性率，同時也可區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌以及檢測結(jié)核菌的耐藥性，但是所需時間較長，可能延誤疾病的診治，增加疾病傳播的風(fēng)險[6]。Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)是由美國Cepheid公司開發(fā)的一個結(jié)核菌檢測平臺，它是一種半巢式的熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，能自動提取rpoB基因進(jìn)行擴(kuò)增，再用分子探針覆蓋81bp核心區(qū)，確定對利福平的耐藥性，該設(shè)備將樣品制備和定量PCR整合在一個封閉試劑盒中自動完成，2h內(nèi)能從患者標(biāo)本中檢測是否含有結(jié)核桿菌以及對利福平的耐藥性[7]。多項研究表明，該技術(shù)對涂陽標(biāo)本的靈敏度達(dá)98%～100%[8-9]。目前，該技術(shù)在結(jié)核病防治中應(yīng)用已被WHO許可。

現(xiàn)階段我國涂陰肺結(jié)核約占所有肺結(jié)核的70%，這些患者咳嗽、咳痰多不明顯，很難留取合格的痰標(biāo)本，目前尚缺乏有效的檢測手段。支氣管鏡檢查能直接觀察氣管、支氣管及更遠(yuǎn)端，可以進(jìn)行支氣管黏膜活檢；同時可對病灶所在的肺葉、肺段進(jìn)行肺泡灌洗，留取灌洗液進(jìn)行檢測，從而增加陽性率。本研究兩組患者均進(jìn)行支氣管鏡檢查，留取肺泡灌洗液進(jìn)行檢測。觀察組肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測陽性率（73.9%）明顯高于對照組（1.8%），提示Xpert MTB/RIF檢測在涂陰肺結(jié)核患者肺泡灌洗液中有較高的特異度，與牛波等[10]報道結(jié)果一致。觀察組157例患者肺泡灌洗液抗酸染色涂片、分枝桿菌液體及Xpert MTB/RIF檢測陽性率比較結(jié)果：Xpert MTB/RIF檢測法＞分枝桿菌液體培養(yǎng)法＞抗酸染色涂片法，提示肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測對涂陰肺結(jié)核患者的診斷意義優(yōu)于分枝桿菌液體培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法，與李妍等[11]研究結(jié)果一致。Xpert MTB/RIF檢測陽性而分枝桿菌液體培養(yǎng)陰性的55例患者中，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果均為低含量或極低含量，與Rachow等[12]研究結(jié)果一致，提示在含菌量低的標(biāo)本中，Xpert MTB/RIF檢測靈敏度優(yōu)于分枝桿菌液體培養(yǎng)法，更適用于臨床上涂陰肺結(jié)核的診斷。有研究表明，Xpert MTB/RIF檢測對結(jié)核桿菌有特異性，與非結(jié)核分枝桿菌無交叉反應(yīng)[13]，提示臨床上遇到涂片陽性但Xpert MTB/RIF檢測陰性者，需考慮非結(jié)核分枝桿菌的可能。

以分枝桿菌液體培養(yǎng)藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測診斷利福平耐藥的靈敏度為100.0%，特異度為98.0%，兩者一致性良好，與國外報道一致[14-15]。其中有1例患者Xpert MTB/RIF檢測出利福平耐藥，而藥敏試驗提示敏感，因條件限制，未進(jìn)行rpoB基因測序，故最終未明確其耐藥性；后經(jīng)常規(guī)一線標(biāo)準(zhǔn)化方案治療及跟蹤隨訪，患者病灶吸收，病情好轉(zhuǎn)，故考慮為Xpert MTB/RIF檢測假陽性。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，Xpert MTB/RIF檢測假陽性的原因可能有以下3個方面：（1）儀器設(shè)備中B探針循環(huán)閾值延遲，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果[16]；（2）沉默子的突變導(dǎo)致核苷酸位點(diǎn)的改變，但是不改變所編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)[17]；（3）標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌數(shù)量少所致[18]。由于Xpert MTB/RIF檢測存在假陽性的可能，當(dāng)臨床上發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF檢測耐藥時，WHO推薦在進(jìn)行常規(guī)藥物治療的同時對Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果進(jìn)行驗證，包括常規(guī)藥敏試驗或rpoB基因測序等[19]。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測是一種新的結(jié)核病基因診斷技術(shù)，具有快速高效、操作簡單、安全性高、能同時檢測利福平耐藥性等特點(diǎn)，肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測診斷涂陰肺結(jié)核的靈敏度和特異度均較高，建議在涂陰肺結(jié)核患者中開展肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測。

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