食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)分析與應(yīng)用

□ 原亞梅 廣西華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證有限公司

產(chǎn)氣莢膜梭菌是食源性致病菌的一種，其不僅存在于自然界的土壤和水源中，也存在于人和動(dòng)物的腸道中[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌各種類(lèi)型中均含有α-毒素基因，其會(huì)產(chǎn)生α-毒素。因此，α-毒素是最基本的致病因子。近年來(lái)，人們的飲食習(xí)慣發(fā)生了顯著的變化，產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)于食品的污染，是導(dǎo)致人們出現(xiàn)食物中毒和腹瀉的重要原因。然而，產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種厭氧菌，其在檢測(cè)過(guò)程當(dāng)中，由于檢測(cè)環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，因而在檢測(cè)過(guò)程中，其準(zhǔn)確性受到很大的影響。因此，本研究采用PCR檢測(cè)方法對(duì)30份食品污染檢測(cè)項(xiàng)目肉類(lèi)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。在檢測(cè)過(guò)程中，有3份樣品的PCR檢測(cè)方法是陽(yáng)性，采用傳統(tǒng)的培育方法，產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出2株。PCR檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)便、快速以及靈敏度和特異度高，等等。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124；類(lèi)型為A型，帶有CPA毒素基因。其他菌株：腸炎沙門(mén)氏菌亞A（甲）型副傷寒ATCC 9150、福氏志賀氏菌ATCC 12022、空腸彎曲菌ATCC 33291、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19115。

1.2 方法及設(shè)備

產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)過(guò)程中，先將樣品接種在腦心浸出液肉湯中，溫度為（37±1）℃，時(shí)間為18 h。然后，使用劃線血瓊脂平板等進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，溫度為（37±1）℃，時(shí)間為24 h。此后，接種牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度為（46±0.5）℃，時(shí)間為4 h。最后，待其符合相應(yīng)要求和標(biāo)準(zhǔn)后，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌。

目前，采用的培養(yǎng)基是腦心浸出液肉湯（BHI）、血瓊脂平板（90 mm）、牛奶發(fā)酵培養(yǎng)基、生化試劑等。儀器采用的是廣州微生物科技有限公司生產(chǎn)的設(shè)備和法國(guó)生物梅里埃公司，所有設(shè)備驗(yàn)收合格。

1.3 引物

自行設(shè)計(jì)引物和探針，引物和探針的生產(chǎn)廠家均是上海SANQON公司合成的。探針使用的標(biāo)記是FAM。

1.4 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系的總體積、模板、緩沖液分別為25 μL、5 μL、2.5 μL。上下游引物以及探針均為25 pmol。PCR反應(yīng)條件：溫度為94 ℃，預(yù)變性時(shí)間為5 min；溫度為94 ℃，變性時(shí)間為1 min；溫度為57 ℃，退火時(shí)間為1 min；溫度為72 ℃，時(shí)間延伸1 min；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；溫度為72 ℃，時(shí)間延伸15 min。采用Mx3005P熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)

樣本檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)如下。①有效：Ct值≤35.00，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。②Ct值在35.0～40，其需要再進(jìn)行一次檢測(cè)。當(dāng)在Ct值＜40時(shí)，但曲線中存在較為明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，則檢測(cè)結(jié)果視為陽(yáng)性，否則視為陰性。同時(shí)，對(duì)于檢測(cè)不到的Ct值，其也被視為陰性。

1.6 特異性與靈敏度分析

對(duì)比沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌，分析PCR的擴(kuò)增情況，主要包括DNA靈敏度和菌液靈敏度，在分析DNA靈敏度時(shí)，采用的是廣州生物公司生產(chǎn)的試劑盒。同時(shí)，采用可見(jiàn)光酸分析儀，對(duì)DNA的濃度進(jìn)行定量分析。菌液靈敏度分析的過(guò)程中，是在產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌后，使用比濁儀，進(jìn)行提取，并采用適宜的方法進(jìn)行稀釋。最后進(jìn)行PCR分析。

1.7 應(yīng)用評(píng)價(jià)

對(duì)30份肉類(lèi)進(jìn)行培養(yǎng)，建立PCR熒光體系，并進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 特異性分析

通過(guò)對(duì)沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌的分析，其只有產(chǎn)氣莢膜梭菌沒(méi)有熒光信號(hào)。

2.2 靈敏度分析

通過(guò)分析產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組的靈敏度，研究發(fā)現(xiàn)，DNA的靈敏度為10 fg，氣莢膜梭菌的菌液的靈敏度為30 CFU/PCR。

2.3 應(yīng)用評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)30份肉類(lèi)食品的檢測(cè)，其每個(gè)樣品均有Ct值。在樣品中，PCR反應(yīng)體系檢出氣莢膜梭菌3份呈現(xiàn)陽(yáng)性，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)后，檢出氣莢膜梭菌2份。因此，相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，PCR檢測(cè)方法，其具有較高的特異性和靈敏性。與此同時(shí)，在監(jiān)測(cè)過(guò)程中，黃鱔的檢出率最高，其檢出率為20.00%，其次是鰱魚(yú)，其檢出率為14.29%。

3 結(jié)論

通過(guò)本文的研究，研究結(jié)果表明所示，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用PCR檢測(cè)方法，其具有較高的特異性，也具有較好的靈敏度。同時(shí)，這種檢測(cè)方法，其還具有較為簡(jiǎn)單的操作方式，觀察結(jié)果也較為直觀。另外，這種檢測(cè)方法，其在檢測(cè)食品過(guò)程中，也比較快速。GB4789.13-2012檢測(cè)方法是我國(guó)已經(jīng)頒布并積極推廣的檢驗(yàn)方法，其對(duì)于樣品制備、活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)以及菌數(shù)計(jì)算等諸多方面均已進(jìn)行了修訂和完善。本研究采用的檢驗(yàn)方法，與GB4789.13-2012檢測(cè)方法相比，符合要求。因此，在食品檢測(cè)中使用這種方法是一種有效的措施和手段。