奶牛乳房炎實驗室診斷技術(shù)研究進展

李德芬，朱俊平

（1．山東省壽光市上口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)管理站，山東 壽光 262700；2．山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東 濰坊 261061）

奶牛乳房炎又叫奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化學、微生物學刺激所發(fā)生的一種炎性反應。奶牛乳房炎不僅使奶牛產(chǎn)乳量下降，降低生鮮乳和乳制品的質(zhì)量，還由于在臨床治療過程中盲目使用抗菌藥，導致乳中藥物殘留升高，污染環(huán)境且危害人類健康［1，2］。及時而正確診斷乳房炎成為防治奶牛乳房炎的關(guān)鍵。

1 加州乳房炎檢測法／蘭州乳房炎檢測法

加州乳房炎檢測法／蘭州乳房炎檢測法（CMT／LMT）基本原理是用一種陰離子表面活性物質(zhì)—烷基或烴基硫酸鹽，破壞乳中的體細胞，釋放其中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與試劑結(jié)合產(chǎn)生沉淀或凝膠。乳中體細胞越多，產(chǎn)生的凝膠也就越多。該方法操作簡單，易于掌握，在臨床中經(jīng)常使用，但結(jié)果受年齡、季節(jié)等多種因素的影響。

CMT法具體操作步驟是先將2 mL被檢乳置于塑料乳房炎檢驗盤中，再加入2 mL CMT試劑（試劑配方：烷基硫酸鈉 30～50 g，苛性鈉 15 g，溴甲酚紫0．1 g，蒸餾水 1 000 mL），緩慢以同心圓狀攪拌 10 s。然后根據(jù)乳汁的顏色與狀態(tài)判定結(jié)果：乳汁無變化，不出現(xiàn)凝塊判為陰性（－）；乳汁出現(xiàn)微量沉淀，不久就又消失的傾向為可疑（±）；乳汁部分形成凝膠狀為弱陽性（＋）；乳汁全部呈凝膠狀，在回轉(zhuǎn)搖動時，凝塊向中央集中，一旦停止搖動，凝塊呈凹凸狀附于皿底為陽性（＋＋）；乳汁全部呈凝膠狀，回轉(zhuǎn)搖動時凝塊向中央集中，停止搖動時仍保持原狀，并固著于皿底為強陽性（＋＋＋）；乳汁變?yōu)辄S色意味著細菌增多，乳糖被分解，乳樣呈酸性；乳汁呈深紫色則乳樣呈堿性［3］。

2 乳汁體細胞計數(shù)（SCC）法

每毫升牛奶中含有細胞的數(shù)目即為體細胞數(shù)（SCC）。在正常的生理狀況下，每毫升牛奶中有2萬～20萬個體細胞。當奶牛的泌乳系統(tǒng)受到不同種類細菌的侵襲而發(fā)生感染及損傷時，通過機體的免疫機制，承擔排除感染與修復任務的白細胞就會在此集聚，該乳腺組織分泌的乳汁中體細胞數(shù)量隨即大幅度上升，這樣，就可通過對乳汁中SCC的變化來判斷是否是隱性乳房炎。大量試驗表明，當牛乳中體細胞數(shù)達 5×105個 ／mL 時，即存在乳房炎隱患［4］。 但體細胞的數(shù)量受年齡和胎次、泌乳期、季節(jié)、機體應激、個體特征以及擠奶操作等因素的影響。

目前，檢測牛乳中體細胞數(shù)的方法有多種，主要有體細胞直接計數(shù)法、電子計數(shù)法、熒光電子細胞計數(shù)法等。

2.1 體細胞直接計數(shù)法

該法檢測結(jié)果最為準確，常作為其他方法的對照。一般認為每毫升乳汁中細胞數(shù)超過50萬定為乳房炎，有的則認為超過25萬即可定為乳房炎［5］。但是，中國農(nóng)科院中獸醫(yī)研究所根據(jù)試驗提出在治療乳房炎判定療效時，每毫升乳汁中細胞數(shù)降至100萬以下就可定為正常，國外也有類似的報道。

2.2 電子計數(shù)法

首先將乳細胞在試管中進行染色，然后用0．65 μm的微孔濾器將染好色的乳汁濾過，使細胞集于濾器上。濾器油浸處理后進行檢查。這種方法操作比較簡單快捷，是一種較為先進的方法。

2.3 熒光電子細胞計數(shù)法

首先將乳樣用緩沖液稀釋并與一種染色劑混合、涂片，然后置于有轉(zhuǎn)盤裝置的顯微鏡上，當轉(zhuǎn)盤經(jīng)過物鏡時，即可將熒光細胞的數(shù)目自動記錄下來。全部操作均為自動化，迅速便捷，每小時可計數(shù)180個乳樣。

3 乳汁中細菌的分離培養(yǎng)與鑒定

取采集的奶樣5 mL置于滅菌離心管中，3 000 r／min離心10 min，棄去離心管中的上層液體，吸取0．1 mL沉淀物分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂和綿羊血瓊脂平板，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。觀察菌落形態(tài)、生長特征，并進行革蘭氏染色鏡檢［6］。

將符合鏈球菌形態(tài)特征的菌株接種于改良愛德華培養(yǎng)基，將符合葡萄球菌形態(tài)特征的菌株接種于綿羊血瓊脂平板，將符合革蘭氏陰性桿菌形態(tài)的菌株接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和S－S瓊脂培養(yǎng)基，初步判定細菌種類，并純化培養(yǎng)，將純培養(yǎng)物保存于試管斜面培養(yǎng)基內(nèi)。根據(jù)初步鑒定結(jié)果對分離到的菌株有選擇地進行生化試驗，接下來通過致病性試驗、藥敏試驗得出細菌較敏感的藥物，供臨床治療參考。

細菌培養(yǎng)診斷法專屬性強，能準確得出致病菌敏感的藥物，便于臨床使用，但細菌培養(yǎng)法需要較長的時間。

4 乳汁pH檢測法

患乳房炎的牛乳汁pH呈堿性，pH隨著體細胞和炎性細胞數(shù)量的增加而變大，正常乳汁的 pH在6．4～6．6；乳中體細胞數(shù)在 20 萬～50 萬／mL 時，乳汁pH 在 6．6～6．8；乳中體細胞數(shù)在 50 萬～500 萬／mL時，乳汁 pH 在 6．8～7．2；乳中體細胞數(shù)大于 500 萬／mL時，乳汁pH在7．2以上。因此，利用牛乳汁pH的變化，可以間接地診斷出奶牛乳房炎及其發(fā)病的程度［7］。

通常使用的方法有溴麝香草酚藍（BTB）法和乳房炎試紙法。利用BTB濾紙片可快速診斷，操作簡單，檢測迅速，靈敏度較高，但當牛乳被摻入堿性物質(zhì)后檢測效果不理想。

5 電導率值檢驗法

電導率檢測法是依據(jù)機體血漿與乳的滲透壓相等，健康奶牛乳汁滲透壓大部分是由氯化鈉和乳糖形成。發(fā)生乳房炎時，血－乳屏障的滲透性改變，Na＋、Cl－進入乳汁，使乳汁電導率上升，此方法能迅速、準確的檢測乳房炎。國內(nèi)外的專家學者在這方面做了大量工作，推出了很多通過乳汁導電性增強的原理來檢測隱性乳房炎的儀器。新西蘭生產(chǎn)的AHI乳房炎監(jiān)測儀僅能顯示隱性、陽性和可疑，但不能顯示炎癥的輕重程度。國內(nèi)在這方面做了很多工作，山西農(nóng)業(yè)大學推出SX－I型乳腺炎診斷儀，隨之又推出CN乳腺炎診斷儀；西北農(nóng)林科技大學研制出 XND－A型乳腺炎診斷儀。

6 氫氧化鈉凝乳試驗法

在乳樣中加入氫氧化鈉，觀察乳汁中是否有凝塊來判斷是否患有乳房炎。乳汁肉眼觀察無異常變化，不透明者為陰性；乳汁出現(xiàn)小顆粒狀物者為可疑；乳汁略微透明，有凝乳塊形成者為弱陽性；乳汁呈水樣透明，有比較大的凝乳塊形成者，奶牛已患上隱性乳房炎；乳汁完全透明，全部呈凝乳塊狀，奶?；加须[性乳房炎的情況比較嚴重［8］?？列遭c凝乳試驗法操作簡單，易于掌握，但試驗結(jié)果無統(tǒng)一明確的標準，結(jié)果易受主觀判斷影響。

7 PCR診斷技術(shù)

目前，PCR診斷已經(jīng)成熟運用于許多疾病的診斷，在奶牛乳房炎的診斷方面也有深入研究。依據(jù)原核生物的rRNA分為 5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且位于同一操縱子上。rRNA基因在大多數(shù)原核生物中都具有多個拷貝，拷貝數(shù)目從1～14個不等。其中16S rRNA序列分析已成為細菌種屬鑒定和分類的標準方法，約有2 500種16S rRNA全序列已被報道。根據(jù)16S rRNA、23S rRNA在不同種的細菌中拷貝數(shù)、長度、堿基排列順序及含有的tRNA基因的數(shù)量和種類不同，可判斷致病菌的種群［2］?；具^程類似于傳統(tǒng)的PCR，包括乳樣的制備、擴增、凝膠電泳。其中無乳鏈球菌和停乳鏈球菌特異性引物的設計就是基于編碼16S rRNA的DNA序列，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌是基于編碼23S rRNA的DNA序列。PCR檢測敏感性高，并可確診感染的菌株，減少了微生物學診斷的繁瑣步驟，省時省力，結(jié)果準確可靠，特異性強，是未來研究的方向之一。