人羊膜間充質(zhì)干細胞旁分泌與自分泌作用的研究進展

駱雪，李文晶，李天舒，王蔚

（中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院綜合科，沈陽 110002）

間充質(zhì)干細胞 （mesenchymal stem cells，MSC）是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細胞，且為同種異質(zhì)群體，國際細胞治療學會對其定義的最小標準為：細胞黏附貼壁生長；高表達CD73、CD90和CD105，低表達CD11b、CD14、CD19、 CD79a、 CD34、 CD45和HLA-DR；可以在體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞［1］。人羊膜MSC （human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs） 是MSC的獨特種群，來源于胎盤羊膜，同來源于骨髓、脂肪、臍帶血、羊水、外周血及其他組織的MSC相似。hAMSCs含量豐富，收集和獲得相對容易，幾乎不存在倫理學爭議。hAMSCs不表達端粒酶，具有多重分化潛能［2］、低免疫原性和低瘤性，其低瘤性不受冷凍保存的影響［3］，低免疫原性和低瘤性為hAMSCs的同種異體移植提供了可能。最近的研究［4］表明，hAMSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，包括影響T細胞增殖，抑制樹突狀細胞改變和成熟；還可以抑制幾種免疫細胞的活性和功能，抑制脂多糖 （lipopolysaccharides，LPS） 刺激單核巨噬細胞 （mononuclear macrophage，THP-1） 分泌腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α） 和白細胞介素1β （interleukin 1 beta，IL-1β） ?；谝陨蟽?yōu)勢，hAMSCs被廣泛應用于組織工程學與再生醫(yī)學領域。

1 hAMSCs的臨床應用

臨床研究結(jié)果顯示，hAMSCs對促進傷口愈合及血管再生等有顯著作用，因其具有多重分化潛能被廣泛應用于心力衰竭、糖尿病、腦梗死等疾病的治療。

1.1 心臟疾病

成人心肌細胞幾乎沒有再生能力，hAMSCs可以分化為心肌細胞，所以hAMSCs成為心臟再生治療的一種理想的治療方法，用于治療嚴重心力衰竭［5］。動物實驗證實，將hAMSCs移植入心肌梗死的大鼠后，hAMSCs進入心臟并分化為心肌樣細胞［6］。

1.2 糖尿病

目前，胰島素是治療糖尿病的主流方法，但是胰島素治療帶來的免疫排斥反應和胰島素供應不足阻礙了它的廣泛使用。文獻［7］報道，可以通過移植MSC治療I型糖尿病，逆轉(zhuǎn)高血糖現(xiàn)象。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，將端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因電轉(zhuǎn)染的hAMSCs移植到糖尿病大鼠模型后，大鼠血糖得到明顯控制，胰島損傷減輕，糖尿病得到了有效治療。劉亮等［10］發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯聯(lián)合hAMSCs協(xié)同治療糖尿病早期并發(fā)癥——視網(wǎng)膜病變也有顯著的療效。

1.3 其他應用

移植的hAMSCs可以在大鼠腦梗死區(qū)域定殖、存活并分化為神經(jīng)元樣細胞，改善腦梗死帶來的神經(jīng)損傷現(xiàn)象。將羊膜MSC移植至局灶性腦缺血的動物模型中，缺血區(qū)域神經(jīng)元樣細胞顯著增多，神經(jīng)損傷得到良好的修復，因此，hAMSCs移植成為治療腦血管損傷類疾病的一種新型治療手段。hAMSCs還可以通過旁分泌機制和免疫調(diào)節(jié)持續(xù)改善阿爾茨海默病的病理和記憶功能［11-14］。此外，移植hAMSCs還能抑制順鉑化療所致的骨髓損傷，改善骨髓抑制所致造血功能障礙。

2 hAMSCs的旁分泌與自分泌作用

研究［15］證實，干細胞發(fā)揮再生作用主要是通過旁分泌與自分泌途徑。hAMSCs是一種特殊的MSC，其旁分泌與自分泌作用與MSC類似。旁分泌是指細胞產(chǎn)生的激素或調(diào)節(jié)因子通過細胞間隙對鄰近的其他細胞 （同種或異種） 起調(diào)節(jié)作用。MSC的旁分泌作用可分為營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)、抗瘢痕形成和化學趨化。MSC的營養(yǎng)作用又可以進一步細分為抗凋亡、刺激有絲分裂、支持器官內(nèi)在前體的增殖、分化及血管生成。自分泌是指分泌的細胞因子主要作用于產(chǎn)生細胞因子的細胞本身，調(diào)節(jié)細胞自身和鄰近同類細胞的活性，多數(shù)在局部發(fā)揮效應。MSC的旁分泌與自分泌作用主要是通過大量已知的細胞因子進行調(diào)節(jié)。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)，通過與相應受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞生長、分化和效應，調(diào)控免疫應答。有研究［16-17］發(fā)現(xiàn)MSC不僅可以影響T細胞，還可以通過旁分泌作用抑制或促進B細胞增殖，抑制自然殺傷細胞 （natural killer cell，NK） 細胞活化，并調(diào)節(jié)樹突狀細胞和巨噬細胞分泌細胞因子。

MSC的旁分泌與自分泌作用在組織修復中起重要作用。在組織損傷的第一階段，MSC分泌肝細胞生長因子 （hepatocyte growth factor，HGF） 、血管內(nèi)皮細胞生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 、轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 、堿性成纖維細胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF，又稱FGF2） 和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 （granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF） 增多［17］，這些細胞因子能夠促進其他細胞生長、血管再生、抗纖維化、抗凋亡，促進自身分化為成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞等。

hAMSCs可以分泌多種細胞外基質(zhì)、細胞因子、生長因子及生物活性蛋白［18］。實時PCR檢測結(jié)果顯示，-80 ℃保存1個月的人羊膜中仍可見8種生長因子［EGF，TGF-α，角質(zhì)細胞生長因子 （keratinocyte growth factor，KGF） ，HGF，bFGF，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3］和2種生長因子受體 （KGFR、HGFR）mRNA的表達。龐希寧等［19］發(fā)現(xiàn)hAMSCs含有豐富的線粒體、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，提示hAMSCs具有大量分泌蛋白質(zhì)的能力，從形態(tài)學結(jié)構(gòu)基礎特征方面為hAMSCs的旁分泌與自分泌作用提供了證據(jù)。

2.1 hAMSCs分泌的細胞因子

2.1.1 EGF：EGF是調(diào)節(jié)糖酵解、蛋白質(zhì)磷酸化、細胞鈣代謝的重要單鏈多肽生長因子，可以誘導分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、VEGF、白細胞介素8 （interlukin-8，IL-8）、表皮生長因子1和2 （eprthelial growth factor-1/2，EGR-1/2） 的表達［15］，促進細胞增殖、表皮再生、血管形成，刺激表皮細胞合成分泌透明質(zhì)酸，促進結(jié)締組織細胞的生長［20］。EGF能在mpBM-MSC中激活表皮生長因子受體信號通路［21］，影響細胞增殖、凋亡和遷移。EGF還可以作用于hAMSCs自身，促進體外培養(yǎng)hAMSCs的遷移［22］。

2.1.2 HGF：HGF是一種多功能間充質(zhì)來源的細胞因子，具有強大的促進血管生成、促進細胞侵襲和遷移［23］、抗凋亡和神經(jīng)再生效應［24］。文獻［25］報道，HGF/Met （酪氨酸激酶受體） 能拮抗TGF-β1，預防纖維化，調(diào)節(jié)心肌細胞自噬，在組織損傷后的心血管重塑中起重要作用，但也有學者［26-28］發(fā)現(xiàn)激活HGF/Met會促進癌細胞的增殖和擴散，增加其侵襲性。近年來，HGF被應用于多種疾病的治療，如通過抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡治療慢性阻塞性肺病，減輕神經(jīng)病理性疼痛，修復鼠面部擠壓傷所造成的面神經(jīng)損傷，延緩慢性腎臟病纖維化進展，治療動脈硬化引起的嚴重肢體缺血［24，29-32］。

2.1.3 TGF-β：TGF-β能夠促進蛋白酶抑制劑的合成，上調(diào)細胞黏附分子，抑制基質(zhì)蛋白酶的合成，刺激細胞外基質(zhì)蛋白的合成及沉積，被認為是在傷口愈合過程中控制成纖維細胞活性中最有影響力的生長因子［28］。BENGHUZZI等［33］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度TGF-β1可以有效促進傷口愈合并預防手術(shù)修復中肌腱的纖維化。臨床上可以通過抑制部分TGF-β的作用，治療肝纖維化、病理性瘢痕等［34-36］。TGF-β是一種免疫抑制性細胞因子［14］，在腫瘤形成早期能抑制腫瘤增殖，但是在腫瘤形成以后TGF-β受體表達下降，腫瘤細胞逃避TGF-β的負調(diào)控作用，TGF-β反而可促進腫瘤細胞增殖、分化［37］。劉登榜等［38］發(fā)現(xiàn)TGF-β可以促進軟骨細胞增殖、黏附及分化，對骨關節(jié)的軟骨修復與重建起關鍵作用。TGF-β還可以通過協(xié)同其他細胞因子共同發(fā)揮作用，如協(xié)同HGF在腎臟損傷修復中發(fā)揮重要作用［39］。2.1.4 KGF：KGF是成纖維細胞生長因子家族的第7個成員，主要通過旁分泌途徑發(fā)揮作用，可以促進多種組織細胞增殖、分化，促進細胞有絲分裂，抗凋亡。研究［40］證實，KGF-2在體外和體內(nèi)均可促進上皮細胞增殖，加速動物模型的傷口愈合。KGF可以刺激各種組織中上皮細胞的增殖、分化和遷移，目前已成為治療黏膜炎和靜脈潰瘍的臨床藥物［40-42］。

2.1.5 bFGF：bFGF是一種有效的血管生成因子和內(nèi)皮細胞絲裂原，具有促進內(nèi)皮細胞擴散、遷移和促進血管形成的能力［43］。bFGF能促進結(jié)膜上皮細胞的生長，促進眼眶植入物暴露的愈合，可以作為輕度暴露的首選治療措施［44］。同時，bFGF對治療形覺剝奪性近視有顯著效果。bFGF還與組織修復和腫瘤血管生成相關［45］，在長期發(fā)炎的組織中發(fā)揮抗炎作用。有研究［46］發(fā)現(xiàn)，bFGF是促凋亡因子，慢性肺缺血誘導bFGF過表達，導致肺內(nèi)皮細胞功能障礙。

2.2 hAMSCs旁分泌與自分泌作用的生物學功能

2.2.1 促進傷口愈合：KLEIN等［47］利用2組羔羊胎進行了連續(xù)的實驗，發(fā)現(xiàn)hAMSCs能促進胎兒傷口封閉及愈合。LIU等［48］也發(fā)現(xiàn)向小鼠皮膚傷口注射hAMSCs有助于傷口的修復，且對傷口閉合有顯著效果。研究［49］證實，hAMSCs可以通過促進表皮干細胞和毛細血管的再生促進大鼠皮膚傷口的修復，并對促進皮膚全層傷口聯(lián)合放射性損傷的愈合有顯著作用。KIM等［50］發(fā)現(xiàn)hAMSCs可以通過分泌血管生成因子、增強植入分化能力，促進糖尿病引起的慢性傷口的愈合。尤為重要的是，hAMSCs移植不存在免疫排斥，自體和同種異體移植的hAMSCs對于治療兔皮膚缺陷的效果無明顯差異。

2.2.2 促進血管再生：KIM等［51］直接移植hAMSCs至小鼠的缺血后肢，結(jié)果顯示不僅移植成活率高，而且能顯著促進血管生成，對改善后肢局部缺血療效顯著。WARRIER等［52］也發(fā)現(xiàn)，來自無血管羊膜的羊膜MSC具有促進血管生成的傾向，是需要快速血管生成的組織修復、中風和缺血性疾病治療的理想選擇。

2.2.3 抗炎癥：KANG等［53］發(fā)現(xiàn)hAMSCs可以分泌以IL-10為代表的抗炎細胞因子，參與細胞調(diào)節(jié)，促進抗炎細胞的擴散和激活。hAMSCs能夠分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2） 、TGF-β和HGF，抑制免疫細胞產(chǎn)生炎性細胞因子。SHU等［4］也發(fā)現(xiàn)hAMSCs的上清液可以抑制LPS刺激THP-1產(chǎn)生TNF-α和IL-1β。進一步證明了hAMSCs通過旁分泌作用發(fā)揮抗炎活性。

3 hAMSCs對成骨細胞的影響

骨重建需要“耦合”、協(xié)調(diào)破骨細胞和成骨細胞的功能，第一步是破骨細胞引起的骨吸收，然后是成骨細胞的增殖、黏附、分化［54］。研究［55］表明，影響成骨細胞生長、分化及黏附的蛋白主要有骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2。hAMSCs可以通過旁分泌與自分泌作用促進這4種蛋白的表達。EGF可通過鈣信使系統(tǒng)，使肌醇三磷酸的鈣流入和積累增加，使胞質(zhì)游離鈣水平增加，膠原合成減少，同時EGF/EGFR系統(tǒng)是成骨細胞凋亡的負調(diào)節(jié)因子。TERAMATSU等［56］證明EGF能誘導骨髓間充質(zhì)干細胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs） 分化，且刺激不同分化趨勢不同，弱而短時間的刺激能抑制BMMSCs成骨分化，強烈持續(xù)的刺激則能夠促進BMMSCs成骨分化。外源性人HGF能夠刺激成骨細胞增殖、分化及成骨活性，還發(fā)現(xiàn)HGF/異種脫蛋白松質(zhì)骨對成骨細胞的堿性磷酸酶活性有明顯的促進作用，并能促進成骨細胞的增殖。已有研究［57］證實，TGF-β可通過調(diào)控成骨細胞的自噬性，促進成骨細胞生長，抑制破骨細胞活化，并促進破骨細胞凋亡，促進新骨形成；TNF-α在骨折愈合及骨組織重塑中的表達水平增高，如果組織缺乏TNF-α，則會導致軟骨礦化延遲，影響新骨形成。王磊等［58］研究證明bFGF是一種存在于骨基質(zhì)中的重要的骨生長信號調(diào)節(jié)因子，可誘導未分化的MSC分化為成骨細胞及軟骨細胞，并能與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2協(xié)同發(fā)揮更好的作用。

hAMSCs可以通過旁分泌與自分泌作用促進成骨細胞的增殖、黏附與分化，但其作用機制現(xiàn)在仍不明確，相關國內(nèi)外文獻較少。相信隨著科學技術(shù)的發(fā)展以及廣大學者的不斷探索研究，在不久的將來就會填補這一領域的空白，闡明hAMSCs旁分泌與自分泌作用的機制，為hAMSCs的研究提供新思路，開辟新的前景。

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