劉月平,劉俊英,郭瑞霞, 丁 妍,賀宇彤,單保恩
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是由腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞分泌的、活化后可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的鋅離子依賴內(nèi)肽酶家族,MMP-9和MMP-13屬于MMPs家族,在MMPs激活過程中起重要作用;主要參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[1-3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)屬于氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子,在缺氧條件下HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平升高,參與腫瘤的生長及侵襲過程[4]。肺腺癌的靶向治療目前已取得突破性進(jìn)展,但仍有部分患者不能采用靶向治療,對于這部分患者我們需要探索新的方法。本文應(yīng)用免疫組化SP法染色檢測MMP-9、MMP-13、HIF-1α的表達(dá),采用實時熒光PCR法檢測患者EGFR突變情況,探討肺腺癌中MMP-9、MMP-13、HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征、EGFR突變及預(yù)后的相關(guān)性,以期為肺腺癌患者的個體治療提供依據(jù)。
1.1臨床資料選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2011年3月~2015年3月所有行EGFR基因檢測的肺腺癌手術(shù)患者存檔資料629例,另選取原切口下癌旁正常組織及肺炎性假瘤樣增生組織各50例作為對照。629例肺腺癌患者中男性317例,女性312例;年齡20~80歲,平均59歲。所有標(biāo)本均為手術(shù)標(biāo)本,術(shù)前未進(jìn)行放、化療。患者均已行EGFR 18~21外顯子基因檢測;切片均經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復(fù)診,按WHO(2015)肺腺癌分型標(biāo)準(zhǔn)分類,伏壁狀腺癌54例、腺泡狀腺癌372例、乳頭狀腺癌76例、實性腺癌93例、黏液腺癌23例、微乳頭狀腺癌11例。
1.2方法10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,每個蠟塊行4 μm厚連續(xù)切片4張,分別用于常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色采用SP法,蠟塊行4 μm厚切片后,置于60 ℃烤箱干燥,貼附120 min。免疫組化采用羅氏Benchmark XT全自動免疫組化儀。MMP-9(濃縮液)及MMP-13(濃縮液)一抗稀釋濃度為1 ∶100,HIF-1α(濃縮液)一抗稀釋濃度為1 ∶50,抗原修復(fù)采用檸檬酸緩沖液高溫高壓熱修復(fù)。陽性對照采用已知的陽性切片,以PBS代替一抗做陰性對照,鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自福州邁新公司,兔抗人MMP-13多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體均購自Abcam公司,DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。
EGFR基因檢測采用實時熒光PCR法檢測EGFR 18~21外顯子基因突變情況,采用羅氏Cobas DNA樣品制備及EGFR突變檢測試劑盒,具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行,并采用羅氏Cobas Z480進(jìn)行PCR分析,直接輸出結(jié)果。
1.3結(jié)果判定MMP-9和MMP-13均以胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒為陽性;HIF-1α陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師分別進(jìn)行獨立閱片,對結(jié)果進(jìn)行評定。按染色強(qiáng)度計分:無陽性著色為0分,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個高倍視野,每視野計數(shù)100個癌細(xì)胞,按陽性細(xì)胞的百分率計分:無陽性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分,11%~50%為2分,51%~75%為3分,≥75%為4分。將兩項結(jié)果相乘:<4分為陰性,≥4分為陽性。
1.4隨訪通過電話隨訪,截止日期為2016年4月,隨訪的終點為隨訪截止日期或患者的死亡日期。電話隨訪的主要內(nèi)容包括患者目前的身體狀況、治療情況等。若無法聯(lián)系到該患者或其家屬,則視為失訪。本組隨訪600例,29例失訪,失訪率為4.6%。
1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。多組率的比較用χ2檢驗,多組之間兩兩比較采用P值修正法,生存曲線采用Kaplan-Meier法,生存率的比較采用Log-rank法,用COX風(fēng)險比例回歸模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1MMP-9、MMP-13、HIF-1α在肺腺癌組和對照組中的表達(dá)629例肺腺癌組中MMP-9、MMP-13、HIF-1α陽性率分別為67.57%、74.88%、60.25%,均明顯高于癌旁正常組(22.00%、16.00%、18.00%)及肺炎性假瘤樣增生組(46.00%、42.00%、38.00%),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,表1,圖1~3)。經(jīng)兩兩比較,肺腺癌與癌旁組織、肺腺癌與炎性假瘤樣增生組織、癌旁組織與炎性假瘤樣增生組織中MMP-9、MMP-13的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.017)。HIF-1α在肺腺癌與癌旁組織、肺腺癌與炎性假瘤樣增生組織中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.017);在癌旁組織與炎性假瘤樣增生組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.017)。
①②③
圖1MMP-9在肺腺癌中的表達(dá),SP法圖2MMP-13在肺腺癌中的表達(dá),SP法圖3HIF-1α在肺腺癌中的表達(dá),SP法
表1 MMP-9、MMP-13、HIF-1α在肺腺癌和對照組中的表達(dá)
*P<0.05
2.2MMP-9、MMP-13、HIF-1α表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系MMP-9在肺腺癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(72.77%)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(64.90%);腫瘤直徑>3 cm者(73.37%)高于腫瘤直徑≤3 cm者(64.88%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。MMP-9與患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、病理分型、EGFR突變及是否胸膜受侵無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
MMP-13在肺腺癌Ⅰ~Ⅲa期患者中的陽性率分別為68.56%、83.88%、83.33%;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(82.16%)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(71.15%);腫瘤直徑>3 cm者(79.90%)高于腫瘤直徑≤3 cm者(72.56%);有吸煙史者(79.73%)高于無吸煙史者(72.13%);差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。MMP-13與患者性別、年齡、病理分型、EGFR突變及胸膜受侵均無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
HIF-1α在肺腺癌組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(65.73%)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(57.45%);有吸煙史者(65.64%)高于無吸煙史者(57.21%);差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。HIF-1α的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤分期、分型、腫瘤大小、EGFR突變及胸膜受侵無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表2)。
2.3生存分析本組629例肺腺癌患者中,生存時間0.4~59.9個月,中位生存時間42.4個月。MMP-9陽性組和陰性組12、24、36個月的累積生存率分別為92.8%、78.6%、53.2%和98.5%、91.3%、89.9%,Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=24.312,P<0.001,圖4)。MMP-13陽性組和陰性組12、24、36個月的累積生存率分別為93.1%、79.3%、60.3%和99.4%、93.6%、88.0%,Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.832,P<0.001,圖5)。HIF-1α陽性組和陰性組12、24、36個月的累積生存率分別為94.1%、79.3%、58.4%和95.5%、88.6%、79.7%,Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.706,P<0.05,圖6)。EGFR突變組和無突變組12、24、36個月的累積生存率分別為97.5%、96.6%、96.3%和95.6%、94.4%、92.9%,Log-rank法比較兩組生存率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.634,P<0.001,圖7)。
表2 MMP-9、MMP-13、HIF-1α表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系
*P<0.05
圖4 MMP-9陽性與陰性組生存曲線
圖5 MMP-13陽性與陰性組生存曲線
圖6 HIF-1α陽性與陰性組生存曲線
圖7 EGFR突變組與無突變組生存曲線
2.4COX回歸模型對各種可能影響生存的預(yù)后因素進(jìn)行單因素分析,結(jié)果顯示:患者男性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤較大、胸膜受侵、有吸煙史、腫瘤分期晚、EGFR突變、MMP-9陽性、MMP-13陽性、HIF-1α 陽性均為肺腺癌患者生存的影響因素,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。將單因素分析有意義的變量納入COX多因素回歸模型,結(jié)果顯示:腫瘤較大、腫瘤分期晚、EGFR突變、MMP-9陽性、MMP-13陽性、HIF-1α陽性均為肺腺癌患者生存狀況的獨立危險因素,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表3)。
表3 肺腺癌患者術(shù)后生存的單因素及多因素分析
MMPs在胚胎發(fā)育、分化、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[5]。MMP-9是MMPs中明膠酶的一種,能夠降解ECM中的Ⅳ型膠原[6],從而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。MMP-13基因位于MMPs級聯(lián)反應(yīng)的中心位置,其能激活MMP-9、MMP-2等多種MMPs,也能被MMP-2、MMP-3和MT-MMP等活化,在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義。惡性腫瘤在生長過程中,由于組織增生過快會造成局部組織的嚴(yán)重缺氧,腫瘤細(xì)胞的缺氧適應(yīng)主要由缺氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo),HIF-1α是HIF的主要氧調(diào)節(jié)亞基,可引起基質(zhì)MMPs的表達(dá)增加,進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。
徐曉艷等[1]報道MMP-9與MMP-13在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)呈正相關(guān),但兩者表達(dá)與肺癌患者腫瘤大小及吸煙情況均無關(guān)。Kuo等[11]認(rèn)為,HIF-1α的表達(dá)與患者吸煙史有相關(guān)性。本實驗結(jié)果顯示,MMP-13、HIF-1α與肺腺癌患者吸煙史有關(guān),有吸煙史者陽性率高(P<0.05),但MMP-9與肺腺癌患者吸煙史無關(guān)(P>0.05);MMP-9、MMP-13均與腫瘤大小有關(guān),腫瘤大者陽性率高(P<0.05);MMP-13與患者腫瘤分期有關(guān)(P<0.05);三者均在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率高(P<0.05)。在肺癌患者吸煙史上多項研究結(jié)果不同,有待增加樣本進(jìn)一步分析。本實驗結(jié)果提示腫瘤惡性程度越高,生長越快,直徑較大腫瘤內(nèi)部不能得到足夠的血液供應(yīng),局部組織、細(xì)胞缺氧顯著,促進(jìn)HIF-1α過表達(dá)。同時HIF-1α上調(diào)其下游靶基因MMP-9的表達(dá),從而降解腫瘤周圍基膜與ECM,為腫瘤侵襲創(chuàng)造條件,以適應(yīng)腫瘤的生長需要。
肺癌尤其是肺腺癌的個體化靶向治療是當(dāng)今研究的熱點,個體化靶向治療方案的制定關(guān)鍵在于鑒別、篩選出能明確預(yù)測患者可獲益于某種靶向治療的分子標(biāo)志物[12]。目前,肺腺癌患者最突出的靶向治療方案為基于EGFR基因檢測基礎(chǔ)上的EGFR-TKI治療。Mulloy等[13]提出:EGFR基因突變導(dǎo)致EGFR有更強(qiáng)的激酶活性和催化效率,使胞外的活化信號更加強(qiáng)烈和持久的向胞內(nèi)表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞持續(xù)異常增殖。本實驗結(jié)果表明MMP-9、MMP-13和HIF-1α的表達(dá)均與患者EGFR突變情況無關(guān)(P>0.05),故有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本、改進(jìn)方法進(jìn)行深入分析。
Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,MMP-9、MMP-13和HIF-1α陽性組12、24、36個月的累積生存率均明顯低于陰性組(P<0.05)。經(jīng)COX回歸模型單因素分析,結(jié)果顯示患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、胸膜受侵、吸煙史、腫瘤TNM分期、EGFR突變、MMP-9、MMP-13、HIF-1α的表達(dá)均為肺腺癌患者生存的影響因素(P<0.05)。將單因素分析有意義的變量納入COX多因素回歸模型,結(jié)果顯示:EGFR突變、MMP-9陽性、MMP-13陽性、HIF-1α 陽性均為肺腺癌患者生存狀況的獨立危險因素(P<0.05)。因此,MMP-9、MMP-13和HIF-1α在肺腺癌中的陽性及EGFR基因突變對患者預(yù)后評估有重要意義。
綜上所述,MMP-9、MMP-13和HIF-1α在肺腺癌組織中均存在過表達(dá),且三者在肺腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中均發(fā)揮重要作用,三者的表達(dá)與肺腺癌EGFR突變情況無關(guān),但均是肺腺癌患者生存狀況的獨立危險因素,因此三者存在獨立或聯(lián)合EGFR突變情況作為肺腺癌患者評估預(yù)后及制定治療方案的可能性。
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