微小RNA 作為骨質(zhì)疏松癥的診斷工具及治療靶標的研究進展

王佳瑤 王春慶

隨著對微小RNA（miRNA）的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在骨質(zhì)疏松中起著舉足輕重的作用,已成為各種生理和病理過程的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。miRNA調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收，有助于維持骨穩(wěn)態(tài)。異常的miRNA 信號傳導(dǎo)可導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)生和發(fā)展，如骨質(zhì)疏松癥。miRNA 可被分泌到循環(huán)中并具有非侵入性生物標志物的臨床潛力，基于此種特性，miRNA 有望成為骨質(zhì)疏松的診斷工具和治療靶標，也將代表未來的研究方向，現(xiàn)就其研究進展綜述如下。

1 miRNA 在骨代謝中的作用

骨代謝是骨吸收和骨形成的協(xié)調(diào)活動，是骨骼不斷拆除和重建的過程[1]。在生長發(fā)育期，骨形成超過骨吸收。一旦成人骨量達到峰值BMD（骨密度），通過破骨細胞和成骨細胞的平衡活動保持數(shù)十年，形成骨穩(wěn)態(tài)。在衰老期，沉積骨的絕對體積減少，這是由于成骨細胞形成減少并加劇分化；此外，破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收，特別是在骨質(zhì)疏松期間逐步增加，使得骨形成和骨吸收之間的比率不平衡，因為形成的骨數(shù)量低于吸收的骨量，導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)的惡化，骨量和骨密度降低，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)的脆性骨折[2]。

骨質(zhì)疏松癥是目前老年人的一種常見且復(fù)雜疾病，目前患病人數(shù)正在急劇增加，據(jù)統(tǒng)計，全世界骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)超過7500 萬人，到2020年，這一數(shù)字將增加約1 400 萬人。骨質(zhì)疏松相關(guān)骨折每年超過150 萬，髖部骨折預(yù)計在2050年達到630 萬，髖部骨折后第一年的死亡率高達20%。骨質(zhì)疏松發(fā)生是多種因素導(dǎo)致的，骨強度的受損，骨微結(jié)構(gòu)的變化使得患病人群骨折風(fēng)險增高[3]。骨質(zhì)疏松也常引起椎骨壓縮骨折，骨折伴有身高降低，腰背部疼痛，脊柱畸形和死亡的風(fēng)險大大增加。它可以將人患有椎體骨折的風(fēng)險增加5～10 倍[4]。

miRNA 是一類進化保守的短非編碼RNA，是各種生物過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在人類基因組估計編碼的miRNA 超過1800 個，預(yù)測每個miRNA都可以調(diào)控幾個靶基因。計算預(yù)測表明，超過50%的人類蛋白質(zhì)編碼基因可能受miRNA 調(diào)控[5]。miRNA 發(fā)揮的調(diào)節(jié)是可逆的，有研究表明反饋/正向調(diào)節(jié)環(huán)在翻譯過程中發(fā)揮修飾作用[6]。大量證據(jù)表明miRNA 可以調(diào)節(jié)骨代謝的過程。

2 miRNA 調(diào)節(jié)骨形成

許多研究已經(jīng)確定了特定miRNA 骨形成及成骨細胞的分化和功能中的重要作用。成骨細胞的分化是骨穩(wěn)態(tài)的重要過程，有研究指出成骨細胞中miR-34 家族的調(diào)節(jié)，在小鼠細胞中，miR-34b 和miR-34c 在成骨細胞分化過程中被BMP-2 誘導(dǎo)并上調(diào)。miR-34b 和miR-34c 通過直接靶向幾種重要的成骨細胞相關(guān)因子（如Runx2、Satb2、Notch1和Notch2）影響成骨細胞的分化。這些實驗表明miR-34b/c 的過表達降低了成骨細胞功能，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松表型[7，8]。在人類MSCs 中，miR-34a 通過靶向Notch 配體Jagged1 抑制成骨細胞分化，導(dǎo)致異位骨形成的體內(nèi)模型中骨形成減少[9]。miR-138 鑒定為人類MSCs 分化和骨形成的負調(diào)節(jié)因子，其在hMSCs 的成骨細胞分化過程中下調(diào)，體外研究顯示miR-138 的過表達抑制了hMSCs 的成骨細胞分化，而miR-138 抑制物通過對miR-138 功能的抑制，促進成骨細胞特異性基因的表達[10]。通過降低成骨細胞標記物骨鈣蛋白（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）的表達水平，miR-221 在成骨分化的C2C12 細胞模型中降低，miR-221 的過表達導(dǎo)致成骨減少。而抑制miR-221 的表達則促進OCN、ALP 和COL1A1活性的增加。此外，RUNX2 被認為是miR-221 的靶標，其反向介導(dǎo)成骨細胞分化[11]。研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-433-3p 通過靶向dickkopf-1（DKK1）促進成骨細胞分化，dickkopf-1 是典型WNT 信號通路的強有力拮抗劑，并且被認為是骨質(zhì)疏松癥的生物標志物[12]。miRNA-4739 可以靶向調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白3（LRP3），促進脂肪形成和抑制人類MSCs 的成骨分化。這是第一次確定了LRP3 hsa-miR-4739 軸在平衡中起著促進人類MSCs 的成骨和脂肪細胞分化的生物學(xué)作用[13]。過表達miR-375 通過靶向Runx2 抑制成骨分化，堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OC）和整合素結(jié)合唾液蛋白（IBSP）等成骨細胞標志物的活性降低[14]。miR-96 通過抑制成骨細胞中肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子（HB-EGF）-EGF 受體（EGFR）信號傳導(dǎo)促進成骨分化[15]。miR-194 通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）介導(dǎo)的Runx2 核轉(zhuǎn)位來促進成骨細胞的分化[16]。在間充質(zhì)干細胞（MSCs）中，miR-124 可通過靶向調(diào)節(jié)Dlx 轉(zhuǎn)錄因子（其中包括Dlx5、Dlx3 和Dlx2 基因）來抑制成骨分化和骨形成[17]。MiR-216a 通過調(diào)節(jié)c-Cbl 介導(dǎo)的磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）/AKT 途徑來增強成骨細胞分化和骨形成[18]。在人MSC 中，miRNA-153 可以通過靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ型（BMPR2）來抑制成骨分化[19]。然而miR-542-3p 則通過靶向調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的信號傳導(dǎo)來抑制成骨細胞分化和增殖，從而抑制骨形成[20]。

3 miRNA 調(diào)節(jié)骨吸收

有研究[21]發(fā)現(xiàn)miRNA 除了調(diào)節(jié)骨形成外，還發(fā)現(xiàn)了與骨吸收相關(guān)的miRNA 的表達模式。miR-503 靶向RANK 使細胞對RANKL 刺激不敏感。拮抗miR-503 增強了骨吸收并減少了體內(nèi)骨量，并且在卵巢切除的小鼠中加速了這種作用。使用miR-503 的模擬物降低了RANK 豐度和骨吸收，并且保護免受卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨丟失[21]。與miR-503相反，在PBMC（外周血單個核細胞）的破骨細胞分化期間miR-148a 表達增加，表明其對破骨細胞的調(diào)節(jié)具有陽性功能。miR-148a 通過抑制V-maf 肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B（MAFB），NFATc1和其他破骨細胞促進因子的負調(diào)節(jié)因子，在體外增強破骨細胞分化和其功能。對miR-148a 施用其抑制物則表現(xiàn)出骨吸收減弱，增加骨形成的現(xiàn)象及增加骨量[22]。miR-34a 在破骨細胞前體中具有最高表達，并且在用RANKL 刺激后表達強烈降低。miR-34a 顯示靶向TGFB 誘導(dǎo)的因子同源框2（Tgif2），這是一種同源域蛋白，其在破骨細胞中具有新的正向調(diào)控功能。Tgif2 的遺傳缺失消除了miR-34a 敲除小鼠的骨吸收增加，表明Tgif2 是破骨細胞中miR-34a 功能所必需的。miR-34a 通過Tgif2 靶向破骨細胞，過表達miR-34a 則顯示出骨吸收的抑制。miR-34a 的模擬物高表達減弱了卵巢切除術(shù)后小鼠的骨丟失[23]。miRNA-17/20a 在糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的成骨細胞中起主導(dǎo)作用，其誘導(dǎo)破骨細胞生成。miRNA-17/20a 可靶向RANKL 并抑制成骨細胞中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的破骨細胞分化，miRNA-17/20a 對破骨細胞生成和骨吸收的抑制作用可歸因于RANKL 表達的阻斷[24]。miRNA-26a在破骨細胞生成的晚期強烈表達。miRNA-26a 模擬異位表達可減弱破骨細胞前體細胞中的破骨細胞和肌動蛋白環(huán)形成，結(jié)締組織生長因子/CCN 家族2（CTGF/CCN2）的表達減少，miRNA-26a 抑制劑的過表達促進RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞形成和功能[25]。miR-144-3p 通過靶向RANK 來調(diào)節(jié)破骨細胞生成，CD14+外周血單核細胞中miR-144-3p 的破壞表達改變了TRAP 活性和破骨細胞特異性基因TRAP，組織蛋白酶K（CTSK）和NFATC[26]。除RANK/RANKL/OPG 信號通路外，miRNA 還可以調(diào)節(jié)與破骨細胞分化相關(guān)的其他信號通路及機制。研究發(fā)現(xiàn)miR-126-5p 過表達可抑制破骨細胞分化，減少巨細胞腫瘤基質(zhì)細胞中的骨溶解形成[27]。

4 miRNA 對代謝性骨病的治療潛力

基于以上miRNA 在骨代謝中的各種影響發(fā)現(xiàn)一些異常的miRNA 表達與骨質(zhì)疏松癥的病理學(xué)有關(guān)。雖然miRNA 的作用是影響骨代謝，但目前骨質(zhì)疏松癥與miRNA 的關(guān)系研究卻很少，有研究表明miRNA 的失調(diào)可能與某些遺傳性疾病有關(guān)，如成骨不全等[28]。此外，miRNAs 已被揭示為骨腫瘤的重要病理因素[29]。miRNA 模擬物或miRNA 抑制物的體內(nèi)遞送是以后對于骨代謝類疾病的研究及治療的重要方向。因此，miRNA 具有診斷和治療骨代謝紊亂的巨大潛力。目前，與骨質(zhì)疏松相關(guān)的miRNA 仍處于起步階段。miRNA 作為各種疾病的非入侵性生物標志物已成為目前疾病研究的熱門。Hackl 等[30]認為如果人類一旦克服了可靠的臨床驗證、參考值、方法的實施及成本效益等特定挑戰(zhàn)，循環(huán)miRNA 就有可能成為骨質(zhì)疏松癥和其他骨病的生物標志物。盡管在動物模型中取得了令人滿意的結(jié)果，但只有少數(shù)miRNA 作為治療靶標進入臨床試驗。有研究報道了36例慢性丙型肝炎病毒（HCV）患者miravirsen（一種抑制miR-122 功能的LNA 修飾的反義核苷酸）的安全性和有效性。Miravirsen 治療導(dǎo)致顯著的病毒學(xué)應(yīng)答，最先進的Ⅱ期臨床研究已經(jīng)完成，結(jié)果為陽性，并且在臨床上沒有觀察到不良反應(yīng)[31]。這些結(jié)果通過靶向內(nèi)源miRNA 清楚地顯示出治療效果。

5 miRNA 在骨質(zhì)疏松癥中的作用

Seeliger 等使用miRNA 微陣列鑒定了一組9 個上調(diào)但未下調(diào)的血清miRNA（miR-93、miR-24、miR-23a、miR-124a、miR-122a、miR-21、miR-125b、miR-100 和miR-148a），并且與30例非骨質(zhì)疏松癥患者相比，這些miRNA 與30例骨質(zhì)疏松癥患者的血清樣本中的骨質(zhì)疏松性髖部骨折相關(guān)[32]。而另有研究者鑒定了來自一組760 個miRNA 中的兩個miRNA，這兩個miRNA 在骨折患者和38例患者的髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎非骨折控制之間有顯著差異表達[33]。Panach 等也在積極尋找血清樣本中miRNA 的異常表達，他們比較了15例骨折患者和12例對照組血清中179 種miRNA 的水平，并鑒定了3 種相對于對照組有效上調(diào)的miRNA（miR-122-5p、miR-21-5p 和miR-125b-5p），這成為骨折中合適的生物標志物[34]。同時來自7例女性近期股骨頸骨折患者和7例女性對照的血清樣本中的175 種miRNA，其中6 個血清樣本中的miRNA 隨著骨折的存在而顯示出顯著的變化（miR-133b、miR-22-3p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、let-7g-5p 和miR-328-3p），然后在11例對照和12例骨折患者中進行測試，這對于之前選擇的miRNA 中的三個來說是顯著的變化[35]。Kocijan 等分析了36例患者和39例對照的187 個miRNA，分為3 組，絕經(jīng)前女性、絕經(jīng)后女性和男性，評估了患有特發(fā)性或絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折的男性和女性受試者的循環(huán)miRNA 特征，一組八個miRNA 在所有三組中都是良好的骨折鑒別標志物[36]。在一項更廣泛的研究中，Heilmeier 等從一組375 個miRNA 中鑒定出4 種血清miRNA的組合，每個小組包含17～19例患者，這些miRNA可以區(qū)分2 型糖尿病患者和骨質(zhì)疏松患者的骨折狀態(tài)的高靈敏度和特異性[37]。在我國Li 等研究了來自120例絕經(jīng)后婦女的血漿樣本中的3 種預(yù)選miRNA，分別為正常、骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥3組。與正常組相比，骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥患者的血漿中這三種miRNA（miR-21、miR-133a 和miR-146）的BMD 的T 水平顯著改變[38]。Bedene 等在17例骨質(zhì)疏松癥和57例對照受試者中研究了9 種miRNA，這些miRNA 在之前的基于骨和骨關(guān)節(jié)炎表達的篩選中顯示出前景，并且鑒定了miR-148a-3p與對照組相比在骨質(zhì)疏松癥患者血漿中顯著更高。血漿miR126-3p 和miR423-5p 與骨質(zhì)量的測量相關(guān)列出的研究揭示了在骨質(zhì)疏松癥患者中循環(huán)miRNA 的重要作用[39]。miRNA 作為最豐富的RNA種類，可以在循環(huán)中很容易地被檢測到。

6 骨質(zhì)疏松癥的生物標志物

盡管在臨床常規(guī)中對標準化工具的認識和發(fā)展有所提高，但骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療仍沒有很好的臨床指標。目前，骨折風(fēng)險評估主要基于通過雙能X 射線吸收測定法（DXA）測量的BMD（面積BMD）和評估臨床評分，如WHO 骨折風(fēng)險評估工具（FRAX）。然而，這兩種方法都有一定缺陷[40]。此外，用于骨轉(zhuǎn)換的血清標志物，如：前膠原1 型N 前肽（P1NP）成骨細胞活性/骨形成和I 型膠原的C末端端肽（CTX）用于破骨細胞活性/骨吸收尚未在診斷中得到驗證，是因為中度骨質(zhì)疏松與骨折的關(guān)聯(lián)有局限性[41]。因此，這就需要新的生物標志物來識別骨質(zhì)疏松人群增加的骨折風(fēng)險。循環(huán)中的miRNA 正在成為骨病中生物標志物的強有力的候選者，如近年來研究所強調(diào)的，旨在鑒定與BMD 相關(guān)的miRNA 特征的研究主要集中在循環(huán)外周血單個核細胞（PBMCs）中的miRNAs[32]。對20例絕經(jīng)后白種人女性的小隊列中的365 個miRNA 進行分析，發(fā)現(xiàn)BMD 低的女性中miR-133a 的表達顯著增高。而從相同受試者分離的循環(huán)B 細胞中的miR-133a表達水平與BMD 無關(guān)，這表明miR-133a 可能是確定絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的單核細胞特異性標記物。這些發(fā)現(xiàn)在另一項研究中得到證實，該研究分析了骨質(zhì)疏松癥患者外周血單個核細胞中721 種miRNA的表達[21]。除了單核細胞外，在120例絕經(jīng)后婦女的中國隊列中，發(fā)現(xiàn)miR-133a 在骨質(zhì)疏松癥婦女的血漿中上調(diào)[38]。而miR-133a 基因位于以前與全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的兩個位點支持miR-133a 與骨質(zhì)疏松癥之間的潛在聯(lián)系[42]。

在單核細胞中鑒定并隨后在血清中發(fā)現(xiàn)的另外 的miRNA 是miR-21-5p。盡 管miR-21-5p 的表達在骨質(zhì)疏松癥女性的PBMC 中下調(diào)，但其在骨質(zhì)疏松患者血清中卻顯著上調(diào)[32,38]。此外，比較骨質(zhì)疏松髖部骨折和非骨質(zhì)疏松性骨折患者血清和骨組織的miRNA 譜，miR-21-5p 在骨質(zhì)疏松癥患者骨組織中表達較高。對來自10例骨質(zhì)疏松性骨折患者和10例對照的兩個合并樣本中的83個miRNA 進行初步篩選，隨后在更大樣本中進行驗證，確定了9 個在骨質(zhì)疏松患者血清活檢中差異表達的miRNA 的較非骨質(zhì)疏松性骨折的患者上調(diào)。其中，5 種miRNAs（miR-21-5p、miR-23a-3p、miR-24-3p、miR-100-5p 和miR-125b-5p）在骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織活檢組織中表達上調(diào)[32]。與骨關(guān)節(jié)炎患者接受髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)相比，西班牙骨質(zhì)疏松性髖部骨折女性血清中miR-21-5p 和miR-125b-5p 也被上調(diào)，此研究支持其作為骨質(zhì)疏松性骨折的有價值生物標志物的潛力[34]。

雖然到目前為止大多數(shù)研究都集中在鑒定絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的miRNA 譜，但最近的兩項研究表明miRNA 是否可以區(qū)分不同骨脆性條件下的骨折狀態(tài)[36，37]。研究中分析了187例患者循環(huán)miRNA 的血清水平，分析了男性和女性患者的病理性骨質(zhì)疏松癥和低創(chuàng)傷性骨折以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和低創(chuàng)傷性骨折患者。與沒有骨折的健康年齡和性別匹配的對照相比，所有3 個亞組都顯示出miRNA 表達譜的差異。在所有3 個亞組中共同調(diào)節(jié)的19 種miRNA 中，8 種（miR-152-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p、miR-324-3p、miR-19b-3p、miR-335-5p、miR-19a-3p 和miR-550-3p）被確定為低創(chuàng)傷性骨折患者的重要鑒別者。而一些miRNA 與骨轉(zhuǎn)換標志物和BMD 相關(guān)，如促進成骨細胞分化和骨形成的miR-29b-3p 與P1NP 呈正相關(guān)[36]。因此，miRNA 不僅可以用作骨折患者的鑒別者，還可以用作骨轉(zhuǎn)換的標志物。

在一項相關(guān)研究[37]中，血清miRNA 特征在80例患有糖尿病性骨病或絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)后婦女的特征隊列中進行了研究。兩個研究組分為4 組：非糖尿病絕經(jīng)后婦女、無骨折非脆性絕經(jīng)后婦女脆性骨折、Ⅱ型糖尿病絕經(jīng)后婦女無脆性骨折、Ⅱ型糖尿病絕經(jīng)后婦女脆性骨折。375 個循環(huán)miRNA 的表達分析顯示，48 種miRNA 可以區(qū)分Ⅱ型糖尿病婦女的骨折狀態(tài)，4 種miRNA 可以區(qū)分糖尿病相關(guān)的骨折。在非糖尿病隊列中，23 個miRNA 在是否骨折的受試者之間存在差異表達。與對照組相比，Ⅱ型糖尿病和非糖尿病患者骨折中3 種miRNA 上調(diào)，3 種miRNA 下調(diào)。進一步多變量分類分析和建模致使miR-550a-5p 和miR-382-3p 被鑒定為糖尿病患者的最佳鑒別者，miR-382-3p 和miR-183p 被鑒定為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥最有希望的循環(huán)miRNA。功能上，在骨折患者中一直下調(diào)的miR-382-3p 強烈增強了人脂肪組織來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞（MSC）的成骨細胞分化。相反，上調(diào)的miR-550-5p 則抑制成骨細胞分化，雖然這些發(fā)現(xiàn)需要進一步驗證，但研究者認為循環(huán)中的miRNA不僅可以作為生物標志物，而且在功能上也很重要，至少可以部分地解釋骨質(zhì)疏松癥和其他骨病的病理機制。

綜上所述，miRNA 可以作為新的生物標志物用于早期診斷和治療，它可能是藥物開發(fā)的潛在目標。然而，為了研究循環(huán)miRNA 在骨質(zhì)疏松癥和骨骼中的重要性，全面大樣本研究和長期隨訪十分必要。因此，miRNA 在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域有廣闊的研究前景，miRNA 不僅成為成骨細胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細胞相關(guān)骨吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)，從而有助于骨量維持，而且異常的miRNA 信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)可以影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。此外，miRNA 還可以從細胞分泌以調(diào)節(jié)骨環(huán)境中的通訊。所以，使用miRNA 作為治療代謝性骨病的診斷工具和治療靶標為臨床研究提供了新思路、新方向。