內(nèi)耳藥物遞送的研究進(jìn)展

袁芳 亓衛(wèi)東

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

內(nèi)耳是位于顳骨巖部內(nèi)高度分化、相對(duì)獨(dú)立的感覺器官，包括耳蝸和前庭，分別管理聽覺和平衡。先天性發(fā)育障礙、耳毒性藥物、噪聲暴露、免疫、外傷等多種因素均可致感覺上皮及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致聽覺以及平衡功能異常，出現(xiàn)聽力下降、眩暈、耳鳴、耳悶等相應(yīng)癥狀。目前臨床上針對(duì)內(nèi)耳損傷的保護(hù)措施主要有藥物治療、手術(shù)干預(yù)、助聽器、物理治療等方法[1]，其中藥物治療占主要地位，然而內(nèi)耳特殊的解剖生理特點(diǎn)很大程度上限制了藥物向特定組織細(xì)胞的分布。

1 內(nèi)耳的解剖生理特點(diǎn)

內(nèi)耳解剖位置隱蔽，體積小且結(jié)構(gòu)精細(xì)，其內(nèi)充滿內(nèi)、外淋巴液，Corti器、壺腹嵴、橢圓囊斑和球囊斑均浸沒于內(nèi)淋巴液中。人類內(nèi)、外淋巴液含量分別只有約8μl和70μl[2]，給藥時(shí)易引起容量和壓力的改變并影響其功能；維持內(nèi)淋巴液中高K+以及外淋巴液中高Na+狀態(tài)對(duì)于聽覺及平衡覺電生理至關(guān)重要，給藥時(shí)需充分考慮離子濃度的穩(wěn)定。內(nèi)耳給藥途徑上存在多個(gè)屏障，這些結(jié)構(gòu)在保持微環(huán)境穩(wěn)定的同時(shí)，也影響了藥物的吸收分布，其中血-迷路屏障在全身給藥時(shí)可阻礙藥物向內(nèi)耳分布；圓窗膜、卵圓窗膜選擇性透過的特點(diǎn)也在很大程度上限制了內(nèi)耳局部給藥的應(yīng)用；耳蝸水管經(jīng)由底回鼓階連通蛛網(wǎng)膜下腔可影響內(nèi)耳藥物濃度并可能由此進(jìn)入腦脊液。

尋找并建立一個(gè)安全高效的內(nèi)耳藥物遞送方法是關(guān)鍵。目前對(duì)于內(nèi)耳給藥技術(shù)的研究主要集中在給藥途徑和藥物載體兩個(gè)方面。

2 內(nèi)耳的給藥途徑

內(nèi)耳存在多種屏障維持內(nèi)耳微環(huán)境和功能的穩(wěn)定，內(nèi)耳通過這些結(jié)構(gòu)與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，理論上藥物也可通過這些結(jié)構(gòu)進(jìn)入。但由于這些膜結(jié)構(gòu)存在選擇性作用，不同藥物由于分子量大小、所帶電荷、脂溶性有無等特性不同，藥物的吸收代謝亦不同。內(nèi)耳給藥途徑主要包括全身給藥、經(jīng)中耳鼓室給藥和內(nèi)耳內(nèi)直接給藥。

2.1 經(jīng)全身給藥

全身給藥可經(jīng)由口服、靜脈注射或滴注、肌肉注射等方式完成。Fowler較早提出靜脈注射鏈霉素可有效控制耳源性眩暈[3]以及后來出現(xiàn)的應(yīng)用氨基糖苷類抗生素治療梅尼埃病[4]。目前臨床中仍廣泛采用皮質(zhì)類固醇激素治療突發(fā)性感音神經(jīng)性聾[5,6]和自身免疫性內(nèi)耳疾病[7]。經(jīng)全身給藥治療內(nèi)耳疾病應(yīng)用廣泛，但存在靶向性差、局部藥物濃度低且分布不均勻、全身副作用大等缺點(diǎn)。藥物經(jīng)過口服、靜滴、肌肉注射等方式進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)血循環(huán)到達(dá)到迷路后，血-迷路屏障的選擇性作用阻礙了藥物向內(nèi)耳的彌散，使得局部藥物濃度和藥代動(dòng)力學(xué)難以達(dá)到理想狀態(tài)。Yang等在豚鼠經(jīng)心內(nèi)注射地塞米松0.5mg/ml/kg，1小時(shí)后外淋巴液中藥物濃度為0.03mg/ml，而此時(shí)血漿中藥物濃度為2.76mg/ml[8]。這表明要想使藥物在內(nèi)耳達(dá)到有效治療濃度，體循環(huán)藥物濃度需更高，有引起毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)。但糖皮質(zhì)激素長期全身用藥可導(dǎo)致肥胖、高血壓、糖尿病、血脂異常、低血鉀、骨質(zhì)疏松、消化性潰瘍和免疫抑制等不良反應(yīng)[9]。全身給藥方式的弊端促進(jìn)了新型給藥方式的發(fā)展。

2.2 經(jīng)中耳鼓室給藥

經(jīng)鼓室給藥是將藥物置于中耳鼓室，隨后藥物可通過圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳鼓階外淋巴液中[10]，繼而隨著外淋巴液流動(dòng)及擴(kuò)散分布到內(nèi)耳的各個(gè)部位。研究提示鼓室內(nèi)藥物也可通過卵圓窗吸收入前庭階，再擴(kuò)散分布到內(nèi)耳的其他部位[11,12]。Schuknecht等人最早進(jìn)行了中耳鼓室給予鏈霉素治療梅尼埃病的嘗試并獲得成功[13]。近年來，相繼研究發(fā)現(xiàn)卵圓窗在中耳給藥時(shí)藥物吸收方面擁有巨大潛力。為能在梅尼埃病的治療中最大可能保存聽力，King E.B.等人嘗試慶大霉素單獨(dú)經(jīng)卵圓窗給藥，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)337mg/ml慶大霉素3ul經(jīng)鐙骨足板給藥和圓窗膜給藥30分鐘，1周后的結(jié)果顯示前者前庭終器及聽覺終器的毛細(xì)胞丟失較后者更加嚴(yán)重，且聽性腦干誘發(fā)電位（ABRs）的閾值更高[12]。他們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中嘗試減少藥物劑量至50mg/ml慶大霉素1ul，仍未能獲得滿意的聽力保護(hù)[14]。關(guān)于慶大霉素治療梅尼埃病中的聽力保護(hù)還需要更多的實(shí)驗(yàn)以獲得最佳的給藥劑量、次數(shù)及作用時(shí)間。中耳鼓室內(nèi)給藥主要有經(jīng)鼓膜、乳突兩種途徑。正常情況下，鼓室僅通過咽鼓管與外部相通，所以經(jīng)鼓膜、耳后乳突徑路進(jìn)入中耳鼓室均屬有創(chuàng)操作。動(dòng)物試驗(yàn)中鼓室內(nèi)給藥采取耳后徑路較多，在但臨床上因耳后乳突徑路創(chuàng)傷大，實(shí)用性不強(qiáng)。目前有關(guān)鼓室內(nèi)給藥的研究多傾向于經(jīng)鼓膜中耳內(nèi)給藥，主要有經(jīng)鼓膜中耳內(nèi)注射、微導(dǎo)管（μCat）置管和Silverstein MicroWick 3種方式。

2.2.1 耳后乳突徑路給藥

通過耳后皮膚切口并切除部分乳突暴露中耳鼓室，然后將藥物置于鼓室[15]，該法因創(chuàng)傷較大，臨床價(jià)值有限。

2.2.2 經(jīng)鼓膜注射

是指經(jīng)鼓膜直接將藥物注射入中耳鼓室。Rauch就突發(fā)性聾患者口服強(qiáng)的松龍和鼓室內(nèi)注射甲基強(qiáng)的松龍的療效進(jìn)行隨機(jī)前瞻性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，治療伊始給予口服或鼓室內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇對(duì)于聽力的保護(hù)均有效且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但口服給藥患者出現(xiàn)血糖變化及胃腸道反應(yīng)[16]。僅就規(guī)避副作用而言，局部給藥有很大的優(yōu)勢(shì)。但因藥物可從咽鼓管引流排出故需多次操作。這一問題促進(jìn)了對(duì)多聚物凝膠、納米載體等的研究，以期改變藥代動(dòng)力學(xué)，減少注射次數(shù)和防止并發(fā)癥發(fā)生。

2.2.3 微導(dǎo)管（μCat）置管

μCat有兩個(gè)管腔，分別用于藥物灌注和液體回吸。μCat以直徑1.5、2.0或2.5mm的球形末端緊靠圓窗龕，另一端置于外耳道可連接于不同的藥物泵系統(tǒng)。Plontke通過該裝置向鼓室內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素治療全身給藥無效的突發(fā)性耳聾，結(jié)果顯示患者聽力得到較大改善[17-19]。但此法同時(shí)存在導(dǎo)管移位、堵塞、顆粒狀組織增生等問題[18]。

2.2.4 Silverstein MicroWick

最先由Silverstein于1999年報(bào)道應(yīng)用于內(nèi)耳的一種給藥裝置，MicroWick是由多聚乙酸乙烯酯制成的長9mm直徑為1mm的微芯。操作在局麻下進(jìn)行，首先在耳內(nèi)鏡輔助下經(jīng)鼓膜開窗并置通氣管于開窗處，微芯由通氣管插入中耳到達(dá)圓窗龕，患者可自行由外耳道滴入藥物，藥物由微芯吸收后傳輸?shù)綀A窗膜并被動(dòng)擴(kuò)散至內(nèi)耳，整個(gè)操作過程侵入性小[20]。Silverstein MicroWick用于臨床已有多年，Hill等人用MicroWick導(dǎo)入慶大霉素治療梅尼埃病24個(gè)月后，76.8%的患者眩暈得到控制，證明Micro-Wick可作為內(nèi)耳長期給藥方式[21]。Suryanarayanan等人也做了類似實(shí)驗(yàn)，對(duì)經(jīng)MicroWick鼓室持續(xù)給予慶大霉素治療梅尼埃病患者以調(diào)查問卷形式進(jìn)行回顧性研究，顯示該病患者眩暈得到有效控制，癥狀明顯好轉(zhuǎn)[22]。Barriate等人經(jīng)MicroWick注入甲基強(qiáng)的松龍可明顯改善難治性突發(fā)性感音神經(jīng)性聾患者的聽力和言語分辨率[23]。雖然Silverstein MicroWick操作侵入性較小，但仍屬于有創(chuàng)操作，有引起持續(xù)性鼓膜穿孔、中耳感染、組織增生等風(fēng)險(xiǎn)[24]。

無論何種方法，經(jīng)中耳鼓室給藥均主要由圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳。有研究表明約1/3的受試者因存在假膜、纖維化或脂肪栓引起圓窗膜阻塞，使得藥物不能有效進(jìn)入內(nèi)耳，這也解釋了為達(dá)臨床療效藥物劑量個(gè)體差異較大的原因[25,26]，圓窗膜結(jié)構(gòu)變異一定程度上限制了經(jīng)鼓室內(nèi)給藥的發(fā)展。Kanzaki等人采用了一種新型耳內(nèi)鏡，它共有3個(gè)管道，包括1個(gè)光纖透鏡和2個(gè)操作通道，一個(gè)通道用于給藥，另一個(gè)通道用于吸除圓窗膜上的粘附物。相比以往的盲法操作，該方法能夠進(jìn)行可視化操作，可以準(zhǔn)確將藥物或給藥裝置置于圓窗膜表面，也可診斷外淋巴瘺進(jìn)行相關(guān)治療[27]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示白蛋白微氣泡超聲技術(shù)可增加內(nèi)耳對(duì)生物素標(biāo)記的異硫氰酸鹽的攝取利用，實(shí)驗(yàn)中將藥物與白蛋白微氣泡混合置于鼓室內(nèi)，在超聲作用下，通過增強(qiáng)圓窗膜的滲透性加強(qiáng)內(nèi)耳對(duì)藥物的吸收，且該操作不影響圓窗膜的完整性，聽覺腦干誘發(fā)電位亦未提示有明顯閾移[28]。這些技術(shù)在一定程度上解決了圓窗膜個(gè)體差異引起的實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果差異的問題。

2.3 內(nèi)耳內(nèi)直接給藥

內(nèi)耳的正常功能依賴于內(nèi)耳微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，即保持內(nèi)外淋巴液的組成、pH值、滲透壓、電位、液體量等的相對(duì)穩(wěn)定，他們的輕微變化也會(huì)導(dǎo)致聽敏降低，同時(shí)出現(xiàn)耳鳴和眩暈[29]。因此內(nèi)耳內(nèi)直接給藥首先要考慮的是盡量減少對(duì)內(nèi)耳微環(huán)境的干擾。

2.3.1 內(nèi)耳開窗注射

關(guān)于內(nèi)耳開窗直接給藥的嘗試較多，主要集中于開窗部位以及控釋技術(shù)二方面。通過耳蝸底回鼓階側(cè)壁或者圓窗膜打孔將藥物直接注入膜迷路的方法相對(duì)簡單，但是底回鼓階通過末端的耳蝸導(dǎo)水管與蛛網(wǎng)膜下腔相連，此處注射藥物會(huì)經(jīng)聯(lián)合管進(jìn)入腦脊液，造成藥物濃度降低以及污染腦脊液可能，且多次注射損傷較大[30]。近期亦有研究表明可經(jīng)蝸尖打孔注射藥物入鼓階，同時(shí)采用控釋技術(shù)，以期達(dá)到藥物濃度均勻分布及減少經(jīng)聯(lián)合管污染腦脊液可能[31,32]。Dai等人在恒河猴分別經(jīng)鐙骨底板激光打孔注射10μl PBS、圓窗膜造孔注射10μl及30μl PBS，觀察治療容積對(duì)內(nèi)耳聽覺和前庭功能的影響，結(jié)果顯示3者對(duì)內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)及功能無明顯影響[33]。上述操作對(duì)技術(shù)要求較高，尚需完善。

2.3.2 修飾人工耳蝸電極給藥

通過修飾人工耳蝸電極，可在人工耳蝸植入時(shí)建立給藥途徑。Krenzlin等人證實(shí)裝載有包含藥物的共聚物基質(zhì)的電極可將藥物持續(xù)釋放至鼓階[34]。目前人工耳蝸攜帶藥物主要是地塞米松以減輕植入后炎癥反應(yīng)。依據(jù)對(duì)電極進(jìn)行修飾共聚物的不同以及所攜帶的藥物濃度不同，藥物的釋放可持續(xù)幾個(gè)月到數(shù)年不等[34-36]。

2.3.3 微流體注射給藥系統(tǒng)

該種方法的核心是通過耳蝸底回打孔向耳蝸外淋巴液中灌注藥物[37]。微流體注射裝置只有1個(gè)通道連接耳蝸鼓階，既是注射導(dǎo)管也是抽吸導(dǎo)管，該系統(tǒng)允許短時(shí)間內(nèi)（1-10s）重復(fù)小劑量（不超過0.2μl）向耳蝸?zhàn)⑸渌幬?，此時(shí)隨著藥物擴(kuò)散和被外淋巴液稀釋，藥物濃度降低，回抽時(shí)抽取等量的含低濃度藥物的液體，可以免除毛細(xì)胞因?yàn)橥饬馨鸵喝萘亢蛪毫Ω淖兌碌膿p傷[38]。此法可有效避免向內(nèi)耳注入高濃度藥物可能導(dǎo)致的毒副作用。

3 內(nèi)耳藥物載體：可分為非基因載體和基因載體

3.1 非基因載體：主要有多聚物凝膠和納米粒子載體。

3.1.1 多聚物凝膠

多聚物凝膠具有很高的粘滯度和粘彈性，可以吸附于中耳避免經(jīng)由咽鼓管的快速排泄。由于多聚物凝膠可較長時(shí)間停留于中耳，故可減少給藥次數(shù)，并使藥物持續(xù)經(jīng)圓窗膜向內(nèi)耳擴(kuò)散[39]。多聚物凝膠也可用于內(nèi)耳內(nèi)直接給藥[35,36]，長期穩(wěn)定釋放可維持內(nèi)耳內(nèi)藥物的有效濃度。但是在選擇多聚物載體時(shí)需考慮其生物安全性、可裝載并長期穩(wěn)定釋放藥物的能力等問題。近年來研究主要集中在透明質(zhì)酸、Poloxamer407、殼聚糖、硅樹脂等[30]。

3.1.2 納米粒子

納米粒子分子量小，直徑小于1μm[40]，能夠裝載藥物到達(dá)靶組織器官，而且無毒副作用[30]。納米粒子載體可以彌補(bǔ)藥物溶解度低、易降解、半周期短等不足之處，但也存在易排泄、不易降解等缺點(diǎn)[30]。日前研究較多的是聚乳酸/羥基乙酸（PLGA）納米粒子、超順磁性Fe3O4納米粒子、脂質(zhì)納米粒子、聚合物囊泡、陽離子聚合體、脂質(zhì)體和納米凝膠等[41]。PLGA可攜帶單一藥物或者混合制劑通過圓窗膜進(jìn)入外淋巴液中，且可明顯提高封裝藥物的生物利用度[42]。納米粒子載體不僅可經(jīng)中耳鼓室局部給藥作用于內(nèi)耳[30]，也可經(jīng)全身給藥靶向定位到內(nèi)耳[43]，亦可作為基因治療中的載體將目的基因?qū)雰?nèi)耳[44-46]。但納米粒子載體因易排出需多次注射。

多聚物凝膠載體和納米載體的聯(lián)合運(yùn)用，可整合兩者的優(yōu)點(diǎn)，保證藥物長期穩(wěn)定持續(xù)向內(nèi)耳擴(kuò)散[47,48]。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖裝載納米顆粒作為混合載體在體外實(shí)驗(yàn)中能夠長期穩(wěn)定釋放裝載藥物的納米粒子，小鼠活體實(shí)驗(yàn)中裝載藥物的納米粒子能完整地通過圓窗膜并分布至蝸管[47]。Naila等人用透明質(zhì)酸脂質(zhì)體凝膠裝載磷酸地塞米松經(jīng)豚鼠鼓膜注射入鼓室，利用透明質(zhì)酸的高粘度和粘膜粘附特性可長期存在于中耳，而脂質(zhì)體則持續(xù)緩慢釋放磷酸地塞米松入內(nèi)耳并轉(zhuǎn)換成地塞米松活性形式，時(shí)間可長達(dá)30天，且對(duì)聽閾無影響[48]。

3.2 基因載體

基因治療作為最具前景的新興技術(shù)，逐漸顯現(xiàn)出在內(nèi)耳疾病治療中的潛力和優(yōu)勢(shì)。基因治療主要包括功能基因表達(dá)和基因沉默兩方面。同非基因藥物治療相似，要取得理想療效，也需要安全高效的給藥方法將目的基因?qū)雰?nèi)耳。

3.2.1 病毒載體

基因治療中經(jīng)典的載體是病毒載體，目前應(yīng)用于內(nèi)耳的病毒載體主要有腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、慢病毒等，但病毒載體作為微生物存在免疫原性，有細(xì)胞毒性及引起炎癥反應(yīng)的可能，且轉(zhuǎn)染效率及攜帶片段大小有一定的限制[49]，這促進(jìn)了對(duì)非病毒載體的研究。

3.2.2 非病毒載體

目前非病毒載體主要包括納米粒子基因載體，蛋白載體以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。不同于病毒載體，納米粒子載體可攜帶不同大小的基因片段轉(zhuǎn)染內(nèi)耳[50]。Yoon等人采用納米載體聚2-羥乙基L-天冬酰胺偶聯(lián)硬脂胺及寡聚精氨酸（PHEA-g-C18-Arg8）成功攜帶綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)及螺旋韌帶[44]。Qi等構(gòu)建了新型重組蛋白載體TAT雙鏈RNA結(jié)合域（TAT-DRBDs），經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)TAT-DRBDs可攜帶Cy3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)耳Corti氏器、壺腹嵴、橢圓囊斑、球囊斑及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率近100%，且未發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)損傷[51]，以此可以敲除特定基因而做到基因沉默。唐朝穎等人通過構(gòu)建羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體（CTNs），證實(shí)CTNs可攜帶miR96成功轉(zhuǎn)染耳蝸基底膜，且細(xì)胞毒性低于陽離子脂質(zhì)體，但轉(zhuǎn)染效率有待提高[52]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）亦可作為基因載體，慢病毒載體能高效感染BMSCs，將重組慢病毒載體感染的BMSCs植入內(nèi)耳，與重組慢病毒載體直接注入轉(zhuǎn)染內(nèi)耳組織相比較，因BMSCs在體內(nèi)可向急性損傷部位遷移，使治療基因靶向分布于病變部位[15]。

4 結(jié)語

由于血-迷路屏障的阻礙，藥物較難通過血液循環(huán)彌散至內(nèi)耳達(dá)到有效濃度并發(fā)揮作用。近年來的研究偏向于經(jīng)鼓室或內(nèi)耳內(nèi)直接給藥，許多新方法的采用和對(duì)既往技術(shù)的改善，其最終目的是使內(nèi)耳藥物遞送更加安全高效。內(nèi)耳藥物治療包括基因治療的有效性首先取決于藥物能否高效安全地運(yùn)送到靶細(xì)胞，但目前尚未找到完美的解決方案。對(duì)于目前研究最多且較成熟的中耳鼓室內(nèi)給藥，各種多聚物凝膠、納米粒子、病毒載體、蛋白載體、以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等載體技術(shù)的進(jìn)步將為藥物安全高效遞送提供可能。