實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)耳基因?qū)胙芯窟M(jìn)展

劉茜 陳偉 郭維維 楊仕明 伊海金 林昶

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科福建省耳鼻咽喉研究所(福州35 0005)

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 解放軍耳鼻咽喉研究所 聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京100853)3清華大學(xué)附屬北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（北京102218）

半世紀(jì)來(lái)，科學(xué)家們假設(shè)外源DNA介導(dǎo)的基因改造技術(shù)可能成為對(duì)人類遺傳疾病的一種有效治療手段，雖然將理論運(yùn)用于臨床實(shí)踐的過(guò)程漫長(zhǎng)而曲折，但基因治療已經(jīng)成為攻克遺傳性耳聾的一項(xiàng)嶄新治療模式而充滿希望。從內(nèi)耳的解剖特點(diǎn)看,由于耳蝸骨迷路和內(nèi)耳血迷路屏障的存在，耳蝸成為一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的器官,為內(nèi)耳基因治療提供

了理想環(huán)境[1]。內(nèi)耳基因治療領(lǐng)域正在快速發(fā)展，隨著不同的新型載體的發(fā)現(xiàn)以及耳聾遺傳學(xué)動(dòng)物模型研究的逐漸增多，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展的內(nèi)耳基因?qū)胙芯恳仓饾u增多，但研究的關(guān)注點(diǎn)多在外源基因在宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，以及基因表達(dá)的分布，而較少的關(guān)注導(dǎo)入手術(shù)前后聽(tīng)覺(jué)功能的變化及保護(hù)。因此，探索一種轉(zhuǎn)染效率高，同時(shí)又能較好地保護(hù)患者聽(tīng)力的基因?qū)爰夹g(shù)十分有必要。

目前內(nèi)耳基因的導(dǎo)入途徑分為兩種:聽(tīng)泡內(nèi)途徑和聽(tīng)泡外途徑。其中聽(tīng)泡內(nèi)途徑包括經(jīng)圓窗途徑和圓窗外途徑。前者有：經(jīng)圓窗顯微注射，圓窗龕明膠海綿+介質(zhì)粘貼等途徑；后者有：鼓階切開(kāi)，前庭階切開(kāi)及中階切開(kāi)等途徑。聽(tīng)泡外途徑包括后半規(guī)管切開(kāi)，內(nèi)淋巴囊途徑及聽(tīng)泡外鼓階顯微注射等途徑。而其中的內(nèi)淋巴囊途徑和中階注射切開(kāi)途徑屬于內(nèi)淋巴導(dǎo)入，其余為外淋巴導(dǎo)入[2]。本文將從近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于內(nèi)耳基因?qū)氲难芯恐谢仡櫽嘘P(guān)內(nèi)耳手術(shù)入路與聽(tīng)力保護(hù)相關(guān)的資料，從而比較經(jīng)圓窗途徑、耳蝸開(kāi)窗、半規(guī)管途徑等的轉(zhuǎn)染率及聽(tīng)力保護(hù)差異。

1 圓窗途徑

1.1 完整圓窗膜滲透導(dǎo)入法

圓窗膜途徑是一種低侵入性載體導(dǎo)入技術(shù)，被認(rèn)為是從中耳傳遞潛在毒性物質(zhì)到內(nèi)耳的主要途徑。臨床上，如：向內(nèi)耳導(dǎo)入激素，慶大霉素已被用于治療突發(fā)性耳聾以及治療梅尼埃病相關(guān)的眩暈。

該途徑的優(yōu)點(diǎn)是：1.未損傷耳蝸結(jié)構(gòu)，基本不造成內(nèi)耳炎癥及損傷。2009年Chen通過(guò)完整圓窗膜滲透法向豚鼠導(dǎo)入以重組腺病毒為載體的Math1基因，發(fā)現(xiàn)完整圓窗膜實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞點(diǎn)狀缺失，轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率為50%，術(shù)后聽(tīng)力與術(shù)前比較無(wú)差異。耳蝸形態(tài)學(xué)研究顯示該方法不會(huì)導(dǎo)致中耳及內(nèi)耳，尤其是圓窗膜的炎癥和破損[3]。2014年Cheng進(jìn)一步驗(yàn)證該方法是微創(chuàng)，安全的[4]。2.能成功轉(zhuǎn)染載體到耳蝸導(dǎo)管附近耳蝸組織，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及毛細(xì)胞，聽(tīng)覺(jué)功能保護(hù)良好。2001年Jero從小鼠完整圓窗膜滲透導(dǎo)入脂質(zhì)體復(fù)合物，在小鼠導(dǎo)入耳同側(cè)的螺旋緣，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及前庭膜發(fā)現(xiàn)有表達(dá)[5]。Jero將脂質(zhì)體載體和腺病毒載體(腺相關(guān)病毒則無(wú)效)轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠的耳蝸時(shí)，成功地將外源基因通過(guò)完整的圓窗膜導(dǎo)入耳蝸組織中并得到表達(dá)[6]。

其缺點(diǎn)則是：1.載體導(dǎo)入具有病毒選擇性。如2001年Jero在向小鼠耳蝸導(dǎo)入腺病毒時(shí)引起了圓窗膜水腫，作者認(rèn)為早期的水腫有增加圓窗膜滲透性的可能，然而長(zhǎng)期的水腫必然引起圓窗膜的增厚及局部炎癥反應(yīng)，影響載體的導(dǎo)入。因此選擇適宜類型的病毒或者非病毒性載體十分重要。2.載體的分布表達(dá)不均。如2015年Wang運(yùn)用納米級(jí)別的復(fù)合物顆粒制作基因載體，成功經(jīng)圓窗膜滲透途徑導(dǎo)入豚鼠耳蝸，其中毛細(xì)胞的表達(dá)如下：底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞81.7±4.71%，中轉(zhuǎn)可達(dá)33.8±9.02%，內(nèi)毛細(xì)胞只表達(dá)在中轉(zhuǎn)以下，且僅為8.9±1.85%。其他研究數(shù)據(jù)均發(fā)現(xiàn)底轉(zhuǎn)表達(dá)較多，頂轉(zhuǎn)表達(dá)較少，存在分布不均的現(xiàn)象[7]。

綜上所述，該途徑侵入性低，是一種理想的導(dǎo)入手段，其研究重點(diǎn)是選擇更具靶向性，分子量小，對(duì)細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高的載體。以及探索新的滲透劑量，濃度和速度，使表達(dá)分布更加均勻。

1.2 圓窗膜注射法

圓窗膜注射法是經(jīng)耳蝸的天然入口通往鼓階的一種入路，可以保護(hù)聽(tīng)力，有較高的轉(zhuǎn)染效率和較少的耳蝸損傷和聽(tīng)力損失。但真實(shí)的轉(zhuǎn)染效率與聽(tīng)力保護(hù)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)注射設(shè)備選擇，液體導(dǎo)入體積，導(dǎo)入速度，及術(shù)后組織覆蓋，是否發(fā)生外淋巴瘺有關(guān)。同時(shí)，圓窗膜注射法也是應(yīng)用最廣的一種導(dǎo)入途徑。

其優(yōu)點(diǎn)是:1.轉(zhuǎn)導(dǎo)率較高:2003年P(guān)raetorius等用腺病毒(Ad5)，經(jīng)圓窗膜顯微注射方式導(dǎo)入小鼠耳蝸，術(shù)中使用立體固定架固定頭部，用36號(hào)針頭注射。發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入后24小時(shí)GFP在螺旋韌帶、內(nèi)毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元上有很強(qiáng)的表達(dá)，外毛細(xì)胞相對(duì)較弱[8]。而2009年Xu同樣經(jīng)圓窗膜向小鼠耳蝸導(dǎo)入Ad-EGFP，術(shù)后出現(xiàn)聽(tīng)力喪失。分析原因可能有兩點(diǎn):一是損傷圓窗膜且填塞圓窗龕(防止外淋巴漏)，影響兩窗相位差從而影響術(shù)后聽(tīng)力；二是顯微注射后可能發(fā)生前庭膜破裂，也是術(shù)后聽(tīng)力喪失的一個(gè)重要原因[9]。

2.表達(dá)的均勻程度較高:如2015年Akil等從圓窗膜穿刺，用腺相關(guān)病毒1型(AAV-1)運(yùn)載VGLUT3基因(AAV1-VGLUT3)導(dǎo)入新生小鼠耳蝸,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染基因表達(dá)在內(nèi)毛細(xì)胞，外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，認(rèn)為其轉(zhuǎn)染率和表達(dá)的均勻程度較高,未造成明顯的Corti氏器損傷。并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年半，這與其他動(dòng)物模型和其他器官系統(tǒng)的表達(dá)時(shí)間一致，避免了耳蝸細(xì)胞的損傷[10]。該實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行注射前先刺破圓窗膜至未見(jiàn)有液體流出時(shí)再進(jìn)行導(dǎo)入，可能這種釋放淋巴液的方法有一定的平衡液體壓力的作用。2017年Shi等通過(guò)圓窗膜導(dǎo)入AAV1，并觀察其在小型豬及豚鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)AAV1在二者毛細(xì)胞中均有表達(dá),在小型豬上，2、3、4周的表達(dá)率分別為 12.00±5.72%，66.50±4.65%，48.25±3.77%。3周時(shí)在內(nèi)毛細(xì)胞中均勻表達(dá)。2、3、4周在內(nèi)毛細(xì)胞，Hensen’s細(xì)胞，內(nèi)柱外柱細(xì)胞，螺旋韌帶，螺旋緣及前庭膜上均發(fā)現(xiàn)表達(dá)。在豚鼠上第2周開(kāi)始出現(xiàn)在毛細(xì)胞的整個(gè)底回區(qū)域，表達(dá)率為84.60±4.56%(達(dá)到峰值)，3周為63.40±3.21%[11]。 此外，2012年Shibata認(rèn)為圓窗膜注射在透明質(zhì)酸(HA)的作用下使得轉(zhuǎn)染的覆蓋面比耳蝸開(kāi)窗術(shù)更廣，并且在不伴有耳蝸內(nèi)液體自然稀釋的作用下通過(guò)HA的作用下實(shí)現(xiàn)主動(dòng)分布[12]，這種作用在Bjurstro?m的文獻(xiàn)報(bào)道中推測(cè)是在圓窗膜上增加了液體的滲透壓。以及增加了膜的滲透性，以及HA本身的高粘度使得試劑與圓窗膜有長(zhǎng)時(shí)間接觸的過(guò)程有利于注射物的轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。

2 耳蝸開(kāi)窗術(shù)

2.1 鼓階開(kāi)窗

理論上來(lái)說(shuō)，在Corti器中，科蒂淋巴成份與外淋巴相似，通過(guò)韁孔及骨螺旋板中的小孔與鼓階中的外淋巴相通。毛細(xì)胞頂部表皮板與內(nèi)淋巴接觸，其他部分浸浴在科蒂淋巴中并由其供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)。這種結(jié)構(gòu)構(gòu)成了經(jīng)鼓階外淋巴導(dǎo)入外源基因在Corti器上得以表達(dá)的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

其缺點(diǎn)包括：1.鼓階打孔造成的底回淋巴液波動(dòng)對(duì)應(yīng)于聽(tīng)力高頻部分，鼓階開(kāi)窗有較大可能損害高頻聽(tīng)力。2007年Kanzaki提出腺病毒相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的鼓階注射，在鼓階注射后在4kHz和8kHz處ABR升高約30dB SPL，在16kHz處為超過(guò)40dB SPL[14]。2009年Chen Wei在探索Math1基因的內(nèi)耳導(dǎo)入徑路時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組可見(jiàn)片狀外毛細(xì)胞缺失，內(nèi)毛細(xì)胞個(gè)別缺失。ABR在8kHz時(shí)較術(shù)前升高，16kHz，20kHz較術(shù)前明顯升高。作者認(rèn)為這種損傷主要是手術(shù)操作造成的，機(jī)理可能為，耳蝸鼓階打孔以及病毒懸液的注入引起了耳蝸底回外淋巴液的強(qiáng)烈波動(dòng)，對(duì)應(yīng)于聽(tīng)力高頻部分(16 kHz，20 kHz)，低頻閾值升高的現(xiàn)象有可能是病毒的生物毒性和免疫反應(yīng)造成的[3]。為加強(qiáng)對(duì)聽(tīng)力的保護(hù)，2009年李利等運(yùn)用微量注射器及微量泵向小鼠耳蝸鼓階導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞5ul，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞可經(jīng)耳蝸底轉(zhuǎn)鼓階打孔途徑導(dǎo)入耳蝸，干細(xì)胞在內(nèi)耳成功存活，并且對(duì)內(nèi)耳損傷小(術(shù)前、術(shù)后閾移10dB SPL左右)[15]。2011年Kilpatrick認(rèn)為在向鼓室注射人工外淋巴液時(shí)當(dāng)注射速度在16-32nl/min的區(qū)間時(shí)能提供好的聽(tīng)力保護(hù)結(jié)果[16]

2.存在導(dǎo)入載體分布不均的現(xiàn)象.2012年Shibata在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過(guò)耳蝸底轉(zhuǎn)的鼓階注射后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)eGFP分布受限，主要是在前兩回的鼓階，更高回表達(dá)的缺乏可能是由于外淋巴的“逆流”以及腦脊液由于向缺口流動(dòng)造成的阻力[12]。2013年Wei總結(jié)通過(guò)圓窗膜運(yùn)用微型注射器或者泵將半病毒載體泵入耳蝸鼓階，載體的表達(dá)受限于鼓階和前庭階的內(nèi)壁細(xì)胞，在Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)處未發(fā)現(xiàn)表達(dá)[17]。

綜上所述，鼓階打孔的基因?qū)敕绞綍?huì)引起ABR 10dB SPL左右的閾移，降低載體導(dǎo)入體積和導(dǎo)入速度可一定程度上保護(hù)聽(tīng)力。如何選取與內(nèi)外毛細(xì)胞更親和的表達(dá)載體及濃度，提高內(nèi)外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，精確控制載體導(dǎo)入體積和速度是研究的重點(diǎn)。

2.2 中階開(kāi)窗

相對(duì)于經(jīng)鼓階外淋巴導(dǎo)入表達(dá)載體，中階內(nèi)淋巴導(dǎo)入對(duì)于接觸內(nèi)外毛細(xì)胞更為直接，聽(tīng)力損傷則大于鼓階。

其優(yōu)點(diǎn)是：有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。2007年Kanzaki指出病毒通過(guò)內(nèi)淋巴及中階的外側(cè)壁進(jìn)入到感覺(jué)上皮細(xì)胞，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及血管紋細(xì)胞。載體可能通過(guò)螺旋神經(jīng)節(jié)形成的神經(jīng)的韁孔進(jìn)入神經(jīng)。從中階導(dǎo)入豚鼠內(nèi)耳的途徑特別適用于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[14]，2016年Shu等向新生小鼠中階導(dǎo)入腺病毒GFP載體，發(fā)現(xiàn)所有種類的腺病毒在不同日齡均在底轉(zhuǎn)和中轉(zhuǎn)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有表達(dá)，其中Ad-GFP-Baylor組在P0轉(zhuǎn)染率最高，底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)分別90.8±9.2，84.7±10.6，耳蝸各轉(zhuǎn)內(nèi)毛細(xì)胞，外毛細(xì)胞，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有不同組病毒不同程度的轉(zhuǎn)染，作者認(rèn)為向小鼠中階導(dǎo)入載體可提高轉(zhuǎn)染效率。

其缺點(diǎn)最顯著的是造成聽(tīng)力損失較大，聽(tīng)力測(cè)試顯示中階注射組的聽(tīng)閾高于鼓階注射組?？赡艿脑蛴校?.向該處注射過(guò)多體積的載體于內(nèi)淋巴可能會(huì)引起機(jī)械損傷[18]。2002年Ishimoto等認(rèn)為中階注射時(shí)，大量的外毛細(xì)胞已經(jīng)被破壞[19]。2.中階注射增加了內(nèi)淋巴液的液體壓以及造成前庭膜的破裂從而造成耳蝸內(nèi)的內(nèi)外淋巴液混合,混合的淋巴液改變了內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境的Na+和K+的動(dòng)態(tài)平衡。3.注射處同樣造成了螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋的破壞，直接進(jìn)入的流動(dòng)液體在蓋膜的反作用下給Corti器造成了沖擊損害，該壓力同樣能損害毛細(xì)胞。4.內(nèi)淋巴液在穿刺處的過(guò)量漏出將降低耳蝸內(nèi)的跨膜電位，這將為細(xì)胞產(chǎn)生正常的機(jī)械運(yùn)動(dòng)造成阻礙[16]。

聽(tīng)力保護(hù)方面，2011年Kilpatrick運(yùn)動(dòng)納米微量注射泵從中階向小鼠耳蝸導(dǎo)入腺相關(guān)病毒，術(shù)后小鼠中低頻聽(tīng)力(4kHz-22.6kHz)未發(fā)現(xiàn)明顯改變，高頻聽(tīng)力(32kHz，40kHz，45.2kHz)下降，他認(rèn)為手術(shù)的聽(tīng)力保護(hù)機(jī)制有:①納米微量導(dǎo)入系統(tǒng)的使用可控制注射液體的體積與速度到納米級(jí),最小液體體積可達(dá)到4.6nl，根據(jù)小鼠中階內(nèi)淋巴液體積只有0.19ul，本次注射的量為每次0-4.6nl，間隔一分鐘。可使得耳蝸細(xì)胞逐漸適應(yīng)內(nèi)淋巴壓力環(huán)境的改變而減少損傷。②外科操作方法采用標(biāo)準(zhǔn)非侵襲性步驟，中階骨性外側(cè)壁用牙科鉆磨薄，保留膜性外側(cè)壁的完整，整個(gè)操作過(guò)程內(nèi)淋巴間隙保持完整，從而使得玻璃微量注射器的尖端刺入膜迷路外側(cè)壁時(shí)不伴有內(nèi)淋巴液漏出。此外也有不同的科學(xué)家提出了其他的聽(tīng)力保護(hù)機(jī)制，如:1.小體積注射，出生早期導(dǎo)入病毒。2013年Wang等將腺相關(guān)病毒和慢病毒導(dǎo)入小鼠耳蝸，試圖探究一種病毒通過(guò)中階導(dǎo)入合適時(shí)期的聽(tīng)力保護(hù)策略。本次實(shí)驗(yàn)采用了小體積(0.2ul)量的病毒注射，在大多數(shù)類型的內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)現(xiàn)表達(dá)發(fā)現(xiàn)各種病毒在血管紋的邊緣細(xì)胞和中間細(xì)胞表達(dá)最高并且在小鼠出生后早期病毒導(dǎo)入時(shí)可保護(hù)聽(tīng)力[20]。2.分處注射和緩慢注射。2017年Gao等運(yùn)用基因編輯技術(shù)通過(guò)耳蝸中階導(dǎo)入Cas9-guide RNA復(fù)合物改善小鼠模型的人類遺傳性耳聾，發(fā)現(xiàn)注射組相對(duì)于未注射組ABR聽(tīng)閾在5.66kHz有輕微升高，在8kHz及以上頻率無(wú)明顯改變，聽(tīng)力保存較好[21]。分處注射和緩慢注射可能與聽(tīng)力保護(hù)有關(guān)，Kanzaki指出，5ul的病毒注入未發(fā)現(xiàn)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)染，而25ul的導(dǎo)入則會(huì)引起對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)染，因此病毒在轉(zhuǎn)入組織的分布可能與導(dǎo)入病毒的體積有關(guān)。

2.3 前庭階入路

目前該入路的相關(guān)研究較少，可能是由于前庭階解剖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致。2009年徐金操通過(guò)前庭階打孔的方式，向大鼠內(nèi)耳導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP，導(dǎo)入三天可在耳蝸組織鋪片的耳蝸基底膜，球囊，橢圓囊和半規(guī)管壺腹嵴感覺(jué)上皮上良好表達(dá)。在冰凍切片的Corti氏器外毛細(xì)胞及支持細(xì)胞均有表達(dá)。同時(shí)耳蝸和前庭球囊斑也有良好的表達(dá)，且毛細(xì)胞纖毛形態(tài)正常，表皮板，網(wǎng)狀表面及毛細(xì)胞之間的連接清晰可見(jiàn)。作者認(rèn)為前庭階導(dǎo)入與鼓階導(dǎo)入相比，在解剖上更接近前庭器官，導(dǎo)入病毒后濃度高，在前庭器官的表達(dá)時(shí)間更早，效率更高。同時(shí)前庭膜與基底膜的通透性不一致，基底膜比前庭膜厚而致密，因此從鼓階導(dǎo)入載體比從前庭階導(dǎo)入更難到達(dá)中階[22]。2010年徐金操運(yùn)用前庭階打孔的方法將Ad-Math1-EGFP成功導(dǎo)入大鼠耳蝸。觀察可見(jiàn)導(dǎo)入Ad-Math1-EGFP7天后，耳蝸前庭毛細(xì)胞均未受到損害，與正常對(duì)照大鼠相比，組織形態(tài)正常，觀察到內(nèi)耳注入腺病毒一個(gè)月后，通過(guò)冰凍切片，在熒光顯微鏡下仍可見(jiàn)EGFP的表達(dá)，同時(shí)術(shù)后游泳實(shí)驗(yàn)，CDM-CEP閾值，Click的ABR閾值與術(shù)前均無(wú)明顯差異，可表示前庭功能及聽(tīng)覺(jué)功能未受明顯損傷[23]。

3 前庭及內(nèi)淋巴囊入路

3.1 前庭橢圓囊注射

許多的研究者研究此區(qū)域的藥物損傷后毛細(xì)胞再生問(wèn)題。2002年P(guān)raetorius測(cè)試了一種新的內(nèi)耳基因?qū)氲姆椒?，他運(yùn)用1型單純皰疹病毒作為載體，運(yùn)用在橢圓囊開(kāi)一個(gè)小窗的辦法，有效地將β-半乳糖苷酶的報(bào)告基因?qū)攵?，并在幾乎所有的前庭及耳蝸的神?jīng)元上進(jìn)行表達(dá)而沒(méi)有造成聽(tīng)力損失。

3.2 內(nèi)淋巴囊入路

在內(nèi)耳液體微循環(huán)理論中包括兩個(gè)學(xué)說(shuō)，一個(gè)是Corti提出Guild補(bǔ)充和完善的縱向流動(dòng)學(xué)說(shuō)認(rèn)為內(nèi)淋巴囊具有吞噬和液體重吸收作用。第二個(gè)是輻射流動(dòng)學(xué)說(shuō)，Naftalin和Lawrence發(fā)現(xiàn)內(nèi)淋巴在耳蝸和前庭各處局部的分泌上皮產(chǎn)生，同時(shí)也在這些相應(yīng)的部位重吸收。內(nèi)淋巴的生成及吸收均在膜迷路內(nèi)完成。內(nèi)淋巴囊是內(nèi)淋巴的主要吸收部位，內(nèi)淋巴囊中間部，細(xì)胞具有活躍的離子運(yùn)轉(zhuǎn)功能和吞噬作用。在內(nèi)耳容量，壓力電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)中起著重要作用[24]。有文獻(xiàn)顯示，內(nèi)淋巴入路可以作為一種鼓階入路的補(bǔ)充入路，1999年的Yamasoba通過(guò)內(nèi)淋巴囊入路將腺病毒載體Ad.RSVntlacZ導(dǎo)入豚鼠內(nèi)淋巴囊，內(nèi)淋巴管，在前庭，壺腹，甚至耳蝸都有表達(dá)，主要是在內(nèi)淋巴區(qū)域，血管紋的邊緣細(xì)胞和Corti氏器的支持細(xì)胞等[25]。

4 半規(guī)管入路

2001年Kawamoto首先提出半規(guī)管手術(shù)入路，成功導(dǎo)入了巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子表達(dá)細(xì)菌基因lacZ的腺病毒載體(Ad.CMV–lacZ)。不僅在前庭和耳蝸發(fā)現(xiàn)了病毒的導(dǎo)入，并且也實(shí)現(xiàn)了對(duì)耳蝸功能的保護(hù)。這種手術(shù)入路是來(lái)源于治療人類良性位置性眩暈時(shí)的選擇性迷路切除術(shù)[26]。

其優(yōu)點(diǎn)包括：1.在新生小鼠上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)載體在聽(tīng)覺(jué)細(xì)胞上的高表達(dá)。2012年Gassner在大鼠上進(jìn)行后半規(guī)管的基因?qū)?，發(fā)現(xiàn)在前庭和耳蝸的毛細(xì)胞都有表達(dá)，血管紋上的表達(dá)尤其顯著(數(shù)據(jù)未顯示)[27]。2017年Isgrig等在研究Useher綜合征時(shí)，成功從新生小鼠后半規(guī)管向前庭系統(tǒng)及耳蝸導(dǎo)入腺相關(guān)病毒2/8(AAV8-whirlin)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)半規(guī)管導(dǎo)入病毒在內(nèi)毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)率(71.7-81.2%)較先前的圓窗導(dǎo)入法(15%)有提高[28]。2018年Isgrig等在新生耳聾伴前庭功能障礙小鼠(漩渦小鼠)內(nèi)耳，研究后半規(guī)管入路的基因?qū)胧侄?，成功將腺相關(guān)病毒導(dǎo)入新生小鼠前庭及耳蝸，前庭毛細(xì)胞(橢圓囊毛細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染率為53.1%，耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率為77.1%[29]。

2.實(shí)現(xiàn)了耳蝸功能的保護(hù)從而保護(hù)聽(tīng)力。其保護(hù)機(jī)制有兩方面1.操作上較易，如2003年Nakagawa將新霉素溶液(NM)經(jīng)后半規(guī)管途徑(PSCC)導(dǎo)入小鼠內(nèi)耳認(rèn)為PSCC和水平半規(guī)管途徑(LSCC)在顳骨外較易分離，此外，由于水平半規(guī)管和后半規(guī)管的管壁骨質(zhì)較薄,因此較易將26號(hào)針頭刺入[30]。2.半規(guī)管組導(dǎo)入基因可同時(shí)到達(dá)前庭系統(tǒng)和耳蝸系統(tǒng)，比耳蝸開(kāi)窗法有較低的風(fēng)險(xiǎn)傷到血管和神經(jīng)[26]。

分析半規(guī)管入路轉(zhuǎn)染率較圓窗路徑高的原因，Isgrig認(rèn)為嚙齒類動(dòng)物在耳蝸底轉(zhuǎn)的圓窗旁有大的耳蝸導(dǎo)水管，導(dǎo)入的病毒可能被耳蝸導(dǎo)水管里的腦脊液稀釋或者從此處流失，而降低病毒濃度從而無(wú)法轉(zhuǎn)染分布整個(gè)耳蝸。缺點(diǎn)：不能區(qū)分套管是否接觸到內(nèi)淋巴，骨質(zhì)和套管的接觸處難以用膠封閉，形成漏洞導(dǎo)致內(nèi)外淋巴液漏(Kawamot)。這種基因?qū)胧侄我矠樘剿髌渌蛔兓虻膶?dǎo)入和臨床應(yīng)用提供參考。是一種有希望應(yīng)用于治療人類遺傳性耳聾，前庭功能障礙疾病的手段。然而小鼠模型畢竟和人體有差異。

5 未來(lái)的發(fā)展和展望

目前通過(guò)手術(shù)方法進(jìn)行內(nèi)耳的基因?qū)氲氖侄我呀?jīng)相對(duì)成熟，從圓窗入路到耳蝸開(kāi)窗，以及前庭注射和半規(guī)管注射等，但是仍然存在一些問(wèn)題，比如大多數(shù)文獻(xiàn)只說(shuō)明了轉(zhuǎn)染率的多少而沒(méi)有明確指出導(dǎo)入的成功率的問(wèn)題,對(duì)于大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)而言，再高的表達(dá)率，成功率低則意味著對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的浪費(fèi)，解決此問(wèn)題則需要更完善和標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)流程的制定。轉(zhuǎn)染效率上：中階的導(dǎo)入最為直接有效，但因?yàn)橹苯舆M(jìn)入內(nèi)淋巴，對(duì)導(dǎo)入液體體積和速度要求最高。前庭階則是介于中階和鼓階之間的一種導(dǎo)入方式，并且在前庭的分布也相對(duì)于鼓階和中階有優(yōu)勢(shì)，是一種有潛力的入路手段。鼓階的導(dǎo)入研究相對(duì)較多，如何達(dá)到耳蝸各轉(zhuǎn)的均勻分布十分重要。多處開(kāi)窗，及釋放外淋巴減壓等手段能否保護(hù)聽(tīng)力，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，提高圓窗膜通透性，從而提高載體轉(zhuǎn)染率的外界條件也需要深入研究。聽(tīng)力保護(hù)問(wèn)題上：圓窗膜注射和半規(guī)管入路目前聽(tīng)覺(jué)功能保護(hù)優(yōu)于耳蝸開(kāi)窗入路。

當(dāng)前，大動(dòng)物模型的構(gòu)造已成為實(shí)驗(yàn)研究的發(fā)展趨勢(shì)。進(jìn)一步探索豬的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，如：耳蝸導(dǎo)水管與圓窗的距離，內(nèi)外淋巴液的流體壓力，探索最適合聽(tīng)力保護(hù)的導(dǎo)入量和導(dǎo)入速度。并制定規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提高轉(zhuǎn)染成功率十分必要。