結(jié)核病分子病理學(xué)診斷技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)展

宋婧 車南穎

結(jié)核病(tuberculosis，TB)已經(jīng)存在數(shù)千年，仍然是全球十大死因之一，死亡率在傳染性疾病中排名第一，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。病理學(xué)是診斷結(jié)核病的重要途徑，尤其在痰菌陰性肺結(jié)核和肺外結(jié)核等疑難患者的診斷中發(fā)揮了重要作用[2]。傳統(tǒng)的結(jié)核病病理學(xué)診斷主要依靠常規(guī)病理學(xué)及抗酸染色，可與其他常見(jiàn)的腫瘤和感染性疾病進(jìn)行鑒別[3]；但與其他一些肉芽腫性疾病，例如非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)病的鑒別診斷中遇到很多困難。隨著分子生物學(xué)與病理學(xué)的相互交叉滲透，20世紀(jì)70年代利用分子生物學(xué)技術(shù)研究疾病病因、發(fā)病機(jī)制、形態(tài)變化及功能損傷規(guī)律的新分支學(xué)科——分子病理學(xué)誕生[2]。近年來(lái)，分子病理學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速；在2017年發(fā)表的《中國(guó)結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識(shí)》中提出，分子病理學(xué)檢測(cè)是病理學(xué)確診結(jié)核病的主要依據(jù)。分子病理學(xué)可以有效解決結(jié)核病與NTM病的鑒別診斷，以及耐藥結(jié)核病的診斷等傳統(tǒng)病理學(xué)所無(wú)法完成的難題[4]。筆者從分子病理學(xué)診斷結(jié)核病、NTM病及耐藥結(jié)核病等3個(gè)方面對(duì)近幾年分子病理學(xué)診斷技術(shù)在臨床中的應(yīng)用進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述。

分子病理學(xué)診斷結(jié)核病

TB的早期診斷是臨床治療的關(guān)鍵，分子病理學(xué)技術(shù)是診斷TB快速、有效的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新的PCR及其衍生技術(shù)的應(yīng)用，進(jìn)一步提高了TB病理學(xué)診斷的敏感度和特異度。

一、常用PCR技術(shù)

PCR是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將一個(gè)或幾個(gè)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)DNA拷貝擴(kuò)增到百萬(wàn)數(shù)量級(jí)。為了提高PCR診斷的敏感度和特異度，基于普通PCR的新型分子診斷技術(shù)大量涌現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定性及定量的分析；巢式PCR通過(guò)設(shè)計(jì)“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對(duì)引物進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，提高了微量靶序列檢出的敏感度和特異度。董宇杰等[5]回顧性分析了胸腔鏡活檢獲取的36例結(jié)核性胸膜炎患者福爾馬林固定石蠟包埋組織標(biāo)本(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)，25例經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)MTB-DNA陽(yáng)性，敏感度為69.4%，GeneXpert檢測(cè)胸腔積液的敏感度僅為12.5%，活檢組織MTB-DNA檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎診斷中具有重要價(jià)值。穆晶等[6]分別用RT-qPCR與抗酸染色檢測(cè)93例骨關(guān)節(jié)結(jié)核FFPE標(biāo)本，RT-qPCR檢測(cè)的敏感度(82.8%)明顯高于抗酸染色法(68.8%)。McKew等[7]結(jié)合65 kDa(相對(duì)分子質(zhì)量為65 000)熱休克蛋白編碼基因(65-kDa Heat Shock Protein Gene,hsp65 gene)和插入序列6110(IS6110)用RT-qPCR檢測(cè)FFPE標(biāo)本中的MTB，其敏感度(89%)優(yōu)于新鮮組織固體培養(yǎng)(70%)。Seo等[8]對(duì)IS6110和MPB64序列設(shè)計(jì)引物用巢式PCR和RT-qPCR檢測(cè)FFPE標(biāo)本的MTB，巢式PCR的敏感度高于RT-qPCR，能夠達(dá)到70%～87%，4種不同商業(yè)用試劑盒RT-qPCR陽(yáng)性檢出率為31.3%～80.0%不等。巢式PCR的缺點(diǎn)是2次擴(kuò)增中間有開(kāi)蓋過(guò)程，存在污染風(fēng)險(xiǎn)，所以不適用于臨床檢測(cè)。RT-qPCR 只擴(kuò)增1次，耗費(fèi)時(shí)間短，且能對(duì)MTB起始模板進(jìn)行定量分析，更適用于臨床檢測(cè)。

二、多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增DNA樣本的幾個(gè)不同靶區(qū)域片段，節(jié)約樣本，省時(shí)省力。Fukumoto等[9]開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)檢測(cè)病理組織標(biāo)本中細(xì)菌和真菌的“多微生物實(shí)時(shí)PCR”診斷系統(tǒng)，能同時(shí)檢測(cè)68種細(xì)菌和9種真菌。在10例獲得性免疫缺陷綜合征患者尸檢時(shí)取肺部組織檢測(cè)，金黃色葡萄球菌是最常見(jiàn)的微生物(8例)，其次是銅綠假單胞菌(6例)、腸球菌(6例)和白色念珠菌(4例)。此外，在1例肺炎中檢測(cè)到MTB的潛伏感染?！岸辔⑸飳?shí)時(shí)PCR”診斷系統(tǒng)可用于檢測(cè)病理標(biāo)本中的細(xì)菌和真菌，有助于明確診斷感染性疾病。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者利用多重PCR技術(shù)檢測(cè)TB患者FFPE組織標(biāo)本，李子玲等[10]對(duì)結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白65(heat shock protein 65，hsp65)、IS6110和人類β2珠蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示出較高的敏感度和特異度，且可以鑒別MTB和NTM。

三、GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)檢測(cè)技術(shù)

GeneXpert是由美國(guó)Cepheid公司開(kāi)發(fā)的以半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)自動(dòng)運(yùn)行并同時(shí)檢測(cè)MTB和利福平耐藥性的診斷平臺(tái)。Polepole等[11]的研究評(píng)估了GeneXpert檢測(cè)FFPE標(biāo)本診斷肺外結(jié)核的準(zhǔn)確性，以病理組織學(xué)診斷為標(biāo)準(zhǔn)，組織抗酸染色、PCR和GeneXpert診斷淋巴結(jié)結(jié)核的陽(yáng)性率分別為13%(95%CI：5%～27%)、41%(95%CI：27%～57%)和30%(95%CI：18%～46%)；診斷淋巴結(jié)結(jié)核以外的其他肺外結(jié)核，陽(yáng)性率分別為12%(95%CI：2%～38%)、82%(95%CI：56%～95%)和35%(95%CI：15%～61%)，PCR檢測(cè)肺外結(jié)核FFPE標(biāo)本的敏感度較GeneXpert更高。Pandey等[12]的研究表明GeneXpert對(duì)于大多數(shù)肺外結(jié)核新鮮組織標(biāo)本和呼吸道(除痰外)標(biāo)本的檢測(cè)具有潛在價(jià)值，選取腦脊液、胸膜腔積液、淋巴結(jié)組織、膿液，以及支氣管灌洗液等269份樣本，以培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)的敏感度和特異度分別為89%和95%；對(duì)于抗酸染色涂片陽(yáng)性和涂片陰性樣本，GeneXpert檢測(cè)的敏感度分別為100%和77%，特異度分別為94%和96%。GeneXpert檢測(cè)新鮮組織標(biāo)本效果更好，可能與FFPE標(biāo)本制作過(guò)程中，福爾馬林固定液引起蛋白交聯(lián)導(dǎo)致DNA損傷、蠟塊組織保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等因素有關(guān)。

總之，分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病組織病理學(xué)診斷中的應(yīng)用，大大提高了病理學(xué)診斷結(jié)核病的陽(yáng)性率，在結(jié)核病的早期診斷中具有較好的臨床實(shí)用價(jià)值。

分子病理學(xué)診斷NTM病

NTM是分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌[13]。近年來(lái)， NTM從臨床標(biāo)本中的分離率有所增加。NTM病與TB的組織形態(tài)學(xué)相似，抗酸染色也很難區(qū)別，分子病理學(xué)實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)病理學(xué)無(wú)法完成的NTM感染的診斷。

一、多重PCR技術(shù)

目前共發(fā)現(xiàn)154種NTM和13個(gè)亞種，僅少部分對(duì)人體致病。NTM可以侵犯人體肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等器官，并可引起全身播散性疾病[13]。16S rRNA和16S-23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、rpoB、hsp65等基因序列常被用來(lái)鑒別MTB和NTM。Kim等[14]觀察到MTB和NTM感染之間的組織形態(tài)學(xué)基本沒(méi)有差別，用多重PCR和RT-qPCR兩種MTB與NTM檢測(cè)試劑盒檢測(cè)154例分枝桿菌感染患者的FFPE肺組織標(biāo)本，包括137例TB患者和17例NTM病患者(分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為12例胞內(nèi)分枝桿菌，2例膿腫分枝桿菌，1例鳥分枝桿菌，其余2例未鑒定出菌種)。多重PCR檢測(cè)NTM的敏感度略高于RT-qPCR，但兩種方法鑒別MTB與NTM差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sabeti等[15]報(bào)告的1例32歲患有終末期腎病的男性患者，手指病灶有皮下結(jié)節(jié)性病變，F(xiàn)FPE標(biāo)本組織行抗酸染色涂片檢查陽(yáng)性，PCR檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性，進(jìn)一步用多重PCR鑒定出一種生長(zhǎng)緩慢的NTM——M.haemophilum，該菌可在免疫功能低下的患者中引起皮下潰瘍性或結(jié)節(jié)性病變。在患者標(biāo)本抗酸染色涂片檢查陽(yáng)性、MTB-PCR檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)，應(yīng)考慮與NTM病的鑒別診斷。

二、核酸探針雜交技術(shù)

核酸探針雜交技術(shù)的原理是與探針具有一定同源性和互補(bǔ)性的待測(cè)核酸分子在一定的條件下，可與探針通過(guò)氫鍵形成雙鏈分子。這種雙鏈分子經(jīng)過(guò)核素、熒光物質(zhì)或生物素標(biāo)記后，可通過(guò)放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測(cè)出來(lái)[4]。德國(guó)Hain公司開(kāi)發(fā)的以23S rRNA為靶基因鑒定NTM的試劑盒包括GenoType Mycobacterium CM和GenoType Mycobacterium AS，前者鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及常見(jiàn)的15種NTM，包括鳥胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌等，后者用于鑒定臨床少見(jiàn)的其他16 種致病NTM，如恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、胃分枝桿菌等[16]。國(guó)內(nèi)深圳亞能生物公司開(kāi)發(fā)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒采用PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)原理，試驗(yàn)?zāi)l上共有22個(gè)NTM探針位點(diǎn)，標(biāo)本與相對(duì)應(yīng)探針雜交顯色，即檢測(cè)到相應(yīng)的分枝桿菌。北京博奧生物有限公司研發(fā)的分枝桿菌菌種鑒定芯片可以識(shí)別17種 NTM，Zhu等[17]用該芯片檢測(cè)150例MTB和67例 NTM臨床培養(yǎng)分離菌株樣本，生物芯片結(jié)果與16S rRNA測(cè)序結(jié)果一致；195例臨床痰標(biāo)本中，116(59%)例培養(yǎng)陽(yáng)性和79(41%)例培養(yǎng)陰性，生物芯片成功檢測(cè)到全部116例培養(yǎng)陽(yáng)性樣品，同時(shí)檢測(cè)到1株培養(yǎng)陰性的MTB。Munkhdelger 等[18]報(bào)道利用PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)在FFPE 標(biāo)本中成功鑒定了多種NTM。核酸探針雜交技術(shù)較一般PCR具有更高的檢測(cè)通量，一次實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)多個(gè)基因位點(diǎn)，從而鑒別多種NTM。

三、熔解曲線法

熔解曲線法是一種PCR后產(chǎn)物分析技術(shù)，野生型基因有特定的熔解溫度值(Tm)，而突變型基因因?yàn)镈NA雙鏈結(jié)合能力下降導(dǎo)致相應(yīng)的Tm值下降。Tm值下降的幅度與發(fā)生錯(cuò)配的堿基數(shù)目、類型和位置有關(guān)，據(jù)此可以檢測(cè)出突變型和野生型。熔解曲線主要分為高分辨熔解曲線和熒光探針熔解曲線兩種方法。高分辨熔解曲線(high resolution melting，HRM)技術(shù)是PCR擴(kuò)增技術(shù)與熔解曲線分析技術(shù)相結(jié)合，依靠高分辨溫度檢測(cè)PCR儀和新型飽和熒光染料制作熔解曲線實(shí)現(xiàn)基因序列分析的新技術(shù)[19]。Khosravi等[20]使用德國(guó)QIAGEN Type-it HRM PCR試劑盒檢測(cè)98株分枝桿菌臨床分離株，rpoBC操縱子進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR后進(jìn)一步HRM分析，成功鑒定出88株(89.7%)分枝桿菌。Issa等[21]采用16S rRNA基因作為實(shí)時(shí)PCR中的靶標(biāo)，進(jìn)行HRM分析，區(qū)分出不同的分枝桿菌種類?；谔结樀臒晒馊劢馇€分析(fluorescence melting curve analysis，F(xiàn)MCA)是將帶有熒光標(biāo)記的探針-靶序列雜交體熱變性的溫度制作熔解曲線。張俊仙等[22]以DNA直接測(cè)序法為對(duì)照，應(yīng)用FMCA法分析22種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和11種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株DNA測(cè)序一致，成功地建立了FMCA鑒定方法。初步鑒定32株分枝桿菌臨床分離株的結(jié)果顯示，30株(93.8%)快速鑒定到種，2株鑒定到分枝桿菌屬，F(xiàn)MCA具有較高的敏感度。目前，熔解曲線法用于FFPE標(biāo)本分枝桿菌鑒定的報(bào)道較少，未來(lái)還需做進(jìn)一步的研究。

四、高通量測(cè)序

DNA測(cè)序技術(shù)近年在多個(gè)生物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)是通量高、速度快及準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜及較高的成本限制了其在臨床中的應(yīng)用。Bao等[23]最近開(kāi)發(fā)了一種使用16S rRNA PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序(PCR-Seq)快速檢測(cè)和鑒別FFPE標(biāo)本中抗酸菌(acid-fast bacterium，AFB)的方法，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、NTM、諾卡菌屬及其他的AFB，并進(jìn)行了評(píng)估。116例FFPE標(biāo)本抗酸染色涂片陽(yáng)性，其中83例(72%)通過(guò)PCR-Seq鑒定出AFB類型，除識(shí)別出14例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和3例麻風(fēng)分枝桿菌外，還確定了另外19個(gè)AFB菌種。在過(guò)去的幾十年中，NTM和其他AFB(如諾卡菌屬)的感染逐漸上升，肺外組織FFPE標(biāo)本中檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和NTM等AFB顯得越來(lái)越重要。

傳統(tǒng)鑒定NTM的方法操作復(fù)雜，需要2～3個(gè)月時(shí)間，且在多數(shù)情況下無(wú)法獲得明確的鑒定，可能會(huì)延誤 NTM的診斷和治療。分子生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)單、快速，一次檢測(cè)就可以獲得菌種鑒定結(jié)果，對(duì)NTM病的早期診斷具有重要價(jià)值。

分子病理學(xué)診斷耐藥結(jié)核病

根據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織的最新報(bào)告，2016年我國(guó)新發(fā)耐藥結(jié)核病患者5.8萬(wàn)例，但發(fā)現(xiàn)并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診的僅有1萬(wàn)余例[1]。傳統(tǒng)的MTB藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)受生物安全、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等因素影響，不能滿足臨床快速診斷耐藥結(jié)核病的需求。目前，具有生物安全要求級(jí)別低、檢測(cè)時(shí)間短、敏感度較高等特點(diǎn)的耐藥結(jié)核分子生物學(xué)診斷方法日益受到重視。

一、核酸探針雜交技術(shù)

目前研究發(fā)現(xiàn)，MTB耐藥的主要機(jī)制是抗結(jié)核藥物作用位點(diǎn)的靶基因突變，如利福平(RFP)的rpoB81 bp(密碼子507～533)耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determing region，RRDR)、異煙肼(INH) 的KatG和inhA-mabA啟動(dòng)子基因突變等[24]。德國(guó)Hain公司的GenoType MTBDRplus試劑盒是世界衛(wèi)生組織推薦的檢測(cè)MTB耐藥性的方法，能夠可靠地檢測(cè)與INH和RFP耐藥相關(guān)的常見(jiàn)突變。Schaumburg等[25]從14例TB患者FFPE組織標(biāo)本中提取DNA，同時(shí)與基于培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較，評(píng)估核酸探針雜交技術(shù)檢測(cè)MTB對(duì)RFP和INH的耐藥性，結(jié)果顯示出較好的一致性。國(guó)內(nèi)譚景尹等[26]用PCR-膜芯片反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)FFPE標(biāo)本中MTB的耐藥基因突變，在42例MTBIS6110基因陽(yáng)性的標(biāo)本中，檢出INH基因突變2例，RFP或Sm耐藥相關(guān)基因突變各1例，INH、RFP和EMB耐藥相關(guān)基因同時(shí)突變1例，與測(cè)序結(jié)果基本相符。FFPE標(biāo)本提取DNA檢測(cè)INH和RFP耐藥性，較基于培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)周期短，早期即可為患者抗結(jié)核治療藥物的選擇提供指導(dǎo)。Guo等[27]開(kāi)發(fā)和評(píng)估了檢測(cè)耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的快速生物芯片系統(tǒng)。快速生物芯片系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果的一致率為100%。與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，對(duì)于RFP耐藥性的檢測(cè)，快速生物芯片系統(tǒng)檢測(cè)臨床分離株的一致率為91.8%，檢測(cè)痰標(biāo)本為94.6%；對(duì)于INH的耐藥性檢測(cè)，快速生物芯片系統(tǒng)檢測(cè)臨床分離株與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為70.2%，檢測(cè)痰標(biāo)本一致率為78.1%。整個(gè)生物芯片測(cè)定需要6 h，而作為結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法需要2～3個(gè)月。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于該方法的報(bào)道大多數(shù)是用痰或者培養(yǎng)物等標(biāo)本，對(duì)FFPE標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道較少。

二、熔解曲線法

已有學(xué)者報(bào)道用熔解曲線法快速檢測(cè)新鮮組織MTB培養(yǎng)分離株的耐藥突變。Sharma等[28]用HRM在200例肺外結(jié)核患者新鮮組織培養(yǎng)分離菌株中檢測(cè)到22例MDR-TB患者(11%)，3例(1.5%)單耐RFP患者，8例(4%)單耐INH患者。同時(shí)HRM直接從組織中鑒定出另外4例培養(yǎng)陰性的MDR-TB患者。HRM檢測(cè)結(jié)果和測(cè)序的結(jié)果具有100%的一致性。Luo等[29-30]建立了熒光探針熔解曲線技術(shù)檢測(cè)MDR-TB的系統(tǒng)，用臨床分離株對(duì)一線抗結(jié)核藥物和二線抗結(jié)核藥物分別進(jìn)行了驗(yàn)證，并將檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果比較，有較好的一致性。熔解曲線法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果容易判讀，在MTB藥敏試驗(yàn)方面有較好的應(yīng)用前景。

三、GeneXpert檢測(cè)技術(shù)

GeneXpert檢測(cè)技術(shù)針對(duì)rpoB81 bp RRDR設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)是否發(fā)生RFP的耐藥突變，是世界衛(wèi)生組織推薦的快速診斷耐藥結(jié)核病的方法。Polepole等[11]用GeneXpert 技術(shù)檢測(cè)100例肺外結(jié)核患者的FFPE組織標(biāo)本，包括淋巴結(jié)、腹部組織、滑膜組織、皮膚、睪丸組織等，檢出2例對(duì)RFP耐藥的淋巴結(jié)結(jié)核患者，1例對(duì)RFP耐藥的男性睪丸結(jié)核，14例是否對(duì)RFP耐藥不明確。Rindi等[31]用GeneXpert技術(shù)檢測(cè)14例具有TB組織病理學(xué)特征的FFPE標(biāo)本和8例無(wú)TB組織病理學(xué)特征的健康組織標(biāo)本，14例MTB-DNA均為陽(yáng)性且對(duì)RFP敏感，對(duì)照組中均未檢測(cè)到MTB-DNA?？傊?，GeneXpert技術(shù)檢測(cè)FFPE標(biāo)本中的MTB-DNA對(duì)RFP是否耐藥的報(bào)道較少，未來(lái)還需進(jìn)行更多樣本量的研究以評(píng)估其診斷效能。

四、高通量測(cè)序

目前，常用的MTB耐藥基因檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)是檢測(cè)位點(diǎn)有限，不能一次檢出對(duì)所有常用抗結(jié)核藥物的MTB耐藥基因突變。而高通量測(cè)序能夠檢測(cè)所有已知的耐藥基因突變位點(diǎn)，也可以發(fā)現(xiàn)未知的耐藥基因突變。一項(xiàng)大樣本量多中心的研究結(jié)果顯示[32]，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較，基因測(cè)序檢測(cè)MTB臨床分離株對(duì)RFP耐藥的敏感度為91%(靶基因?yàn)閞poB)，檢測(cè)對(duì)INH耐藥的敏感度為86%(靶基因?yàn)閗atG，inhA-fabG啟動(dòng)子組合)，檢測(cè)對(duì)PZA耐藥的敏感度為54%(靶基因pncA)，檢測(cè)對(duì)Ofx耐藥的敏感度為85%(靶基因?yàn)間yrA和gyrB組合)，檢測(cè)對(duì)Mfx耐藥的敏感度為88%(靶基因?yàn)間yrA和gyrB組合)?；驕y(cè)序可能成為監(jiān)測(cè)MTB對(duì)抗結(jié)核藥物是否有耐藥性的重要工具。由于存在對(duì)技術(shù)人員要求高、檢測(cè)設(shè)備昂貴的問(wèn)題，高通量測(cè)序難以在短期內(nèi)廣泛用于臨床對(duì)MDR-TB的檢測(cè)。

早期診斷和及時(shí)進(jìn)行規(guī)范治療是耐藥結(jié)核病防控的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)已有基于核酸探針雜交技術(shù)和熒光探針熔解曲線技術(shù)的耐藥檢測(cè)試劑盒可供臨床使用，但總體上可檢測(cè)的抗結(jié)核藥物不夠全面，且成本較高，需要進(jìn)一步研究更經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確的方法用于耐藥結(jié)核病的診斷。