加強(qiáng)結(jié)核病病理學(xué)診斷的臨床應(yīng)用與研究

陳文 李寧

結(jié)核病是全球死亡例數(shù)最多的傳染性疾病，WHO公布的數(shù)據(jù)顯示，2016年全球約有1040萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，130萬(wàn)例HIV檢測(cè)陰性的結(jié)核病患者死亡。近幾年，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率均呈下降趨勢(shì)，然而耐藥結(jié)核病發(fā)病率卻顯著增加，2016年全球耐利福平結(jié)核病患者新發(fā)60萬(wàn)例，其中49萬(wàn)例為耐多藥結(jié)核病[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)核病病理學(xué)診斷可以為臨床提供更為精準(zhǔn)、明確的診斷，特別是結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病的鑒別診斷，耐藥結(jié)核病的突變位點(diǎn)檢測(cè)等。

國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)于2017年11月9日發(fā)布了《WS 196—2017結(jié)核病分類》與《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》兩項(xiàng)強(qiáng)制性衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并且于2018年5月1日起施行；同時(shí)廢止《WS 196—2001結(jié)核病分類》和《WS 288—2008肺結(jié)核診斷》。在《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)(簡(jiǎn)稱“新標(biāo)準(zhǔn)”)中，顯著提高了病理學(xué)診斷在肺結(jié)核診斷和精準(zhǔn)治療中的地位，筆者就此結(jié)合參考文獻(xiàn)進(jìn)行解讀，以利于新標(biāo)準(zhǔn)的正確實(shí)施，使大家進(jìn)一步明確和了解病理學(xué)診斷對(duì)于結(jié)核病的早期診斷和精準(zhǔn)治療所具有的重要意義。

結(jié)核病的分類及病理改變

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的傳染性疾病，按照發(fā)病部位可分為肺結(jié)核與肺外結(jié)核。新標(biāo)準(zhǔn)將氣管、支氣管和胸膜結(jié)核均歸類于肺結(jié)核。肺外結(jié)核多發(fā)生于淋巴結(jié)、骨與關(guān)節(jié)、皮膚和腸道等。

肺結(jié)核的病理改變主要包括滲出性病變、增生性病變和變質(zhì)性病變。增生性病變是結(jié)核病病理形態(tài)學(xué)最有特征性的改變，顯微鏡下可見具有診斷價(jià)值的結(jié)核結(jié)節(jié)，由上皮樣細(xì)胞、郎罕多核巨細(xì)胞，以及外周聚集的淋巴細(xì)胞和少量增生的成纖維細(xì)胞構(gòu)成。典型者結(jié)節(jié)中央有干酪樣壞死，多為灰黃色，質(zhì)地細(xì)膩形似奶酪。典型結(jié)核(結(jié)核結(jié)節(jié))的病理診斷較容易，而不具備典型結(jié)核病理變化的病例則常需要借助其他的檢測(cè)方法[2]。

肺結(jié)核的病理診斷方法

抗酸染色及結(jié)核分枝桿菌基因檢測(cè)是查找結(jié)核病病原學(xué)證據(jù)的主要手段[3]。新標(biāo)準(zhǔn)顯著提高了病理學(xué)檢測(cè)在肺結(jié)核診斷和精準(zhǔn)治療中的地位，結(jié)核病理學(xué)診斷陽(yáng)性的患者即可確診為肺結(jié)核;影像學(xué) 檢查結(jié)果支持肺結(jié)核的診斷,同時(shí)分子生物學(xué)檢查 陽(yáng)性的患者也可以確診為肺結(jié)核?

一、常規(guī)病理學(xué)診斷

常規(guī)病理標(biāo)本的診斷主要包括大體檢查和顯微鏡下檢查兩部分。典型患者大體檢查可以看到有灰黃色，質(zhì)地細(xì)膩形似奶酪的壞死組織(干酪樣壞死)，這對(duì)于結(jié)核病的診斷具有一定的提示作用；然而目前藥物化療仍然是結(jié)核病的主要治療手段，手術(shù)治療只有在很少的情況下進(jìn)行，因此一般情況下很難獲得完整的結(jié)核病灶組織。顯微鏡下檢查主要是觀察到典型的肉芽腫伴干酪樣壞死病變[4]；應(yīng)該注意的是，肉芽腫病變并非結(jié)核病所特有，亦可出現(xiàn)在霉菌病、結(jié)節(jié)病等其他病變中，因此常規(guī)的病理學(xué)診斷并非結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在病理學(xué)診斷中應(yīng)該結(jié)合其他檢測(cè)手段。

二、特殊染色

診斷結(jié)核病變，需要在病變區(qū)找到結(jié)核病原菌，抗酸染色是最常用的特殊染色方法。切片染色后顯微鏡下常常可以在壞死區(qū)中心或者壞死區(qū)與上皮樣肉芽腫交界處查見紅染的兩端呈鈍圓并稍彎曲的短棒狀桿菌。在抗酸染色檢測(cè)中應(yīng)該注意除了結(jié)核分枝桿菌，麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌也是抗酸染色陽(yáng)性桿菌，肉眼很難分辨，需要進(jìn)一步鑒別；抗酸染色陽(yáng)性率一般較低，抗酸染色陰性不應(yīng)輕易否定結(jié)核分枝桿菌的存在。金胺O熒光染色與抗酸染色的原理類似，均是利用抗酸桿菌的嗜石炭酸性，在熒光顯微鏡下可以查見亮綠色熒光的桿菌，且在暗視野下較抗酸染色更醒目。陳順平等[5]采用金胺O熒光染色檢測(cè)了175例臨床確診為結(jié)核病患者的組織，發(fā)現(xiàn)金胺O熒光染色陽(yáng)性率高達(dá)68.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗酸染色，但該方法需要紫外光源，且無(wú)法長(zhǎng)期保存。此外，網(wǎng)狀纖維染色、六胺銀和過(guò)碘酸鹽希夫染色均對(duì)結(jié)核病的診斷和鑒別診斷具有一定的價(jià)值[6]。網(wǎng)狀纖維染色能夠輔助判斷結(jié)核病的干酪樣壞死，六胺銀和過(guò)碘酸鹽希夫染色對(duì)于結(jié)核病的直接診斷沒有太大的價(jià)值，但可以有效地對(duì)真菌進(jìn)行鑒別診斷。

三、分子生物學(xué)檢查

近幾年，基于基因檢測(cè)的分子病理新技術(shù)飛速發(fā)展，在有效提高組織標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌檢出率的同時(shí)，還能鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，分析結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥性和敏感性，為結(jié)核病早期診斷和精準(zhǔn)治療提供了更多的依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的分子病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉和快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)[7]。對(duì)于一些陳舊性結(jié)核病變，僅有凝固性壞死和纖維化病變，在抗酸染色未找到結(jié)核分枝桿菌的情況下，應(yīng)用PCR對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA進(jìn)行檢測(cè)，敏感度和特異度高，對(duì)于結(jié)核病的確診具有很好的幫助。插入序列6110(IS6110)是結(jié)核分枝桿菌基因組中的一個(gè)保守片段，其由于拷貝數(shù)較多，在同一結(jié)核分枝桿菌基因組中十分穩(wěn)定，因此成為了分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)核病的首選和最常用的片段[8]。然而并非所有的結(jié)核分枝桿菌均表達(dá)IS6110；Rv0577是PCR檢測(cè)結(jié)核感染的另外一種常用片段[9]，IS6110和Rv0577基因雙重PCR可以顯著地提高結(jié)核感染檢測(cè)的特異度和敏感度。應(yīng)該特別注意的是，基于PCR的分子病理檢測(cè)方法敏感度很高，外源性DNA的污染很容易引起假陽(yáng)性的出現(xiàn)，因此分子病理檢測(cè)需在符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中，由受過(guò)專門培訓(xùn)的專業(yè)人員按照規(guī)范化操作規(guī)程進(jìn)行，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利福平和異煙肼是目前的一線抗結(jié)核化療藥物，近年來(lái)耐藥結(jié)核病患者的發(fā)生率越來(lái)越高，分析結(jié)核分枝桿菌的耐藥性對(duì)于結(jié)核病的精準(zhǔn)治療具有重要的意義。核酸雜交技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定，以及耐藥結(jié)核病的診斷中具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。此外，該技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)多種抗結(jié)核藥物耐藥的相關(guān)基因突變。結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變是導(dǎo)致耐利福平的主要機(jī)制之一，katG、inhA基因突變則在結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥中發(fā)揮著重要作用，利用PCR和核酸雜交技術(shù)可以快速檢測(cè)這些基因的突變位點(diǎn)，判斷結(jié)核分枝桿菌的耐受種類和數(shù)量，為下一步的精準(zhǔn)治療提供指導(dǎo)[10-12]。

四、免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、可長(zhǎng)期保存等優(yōu)勢(shì)，在疾病的診斷，特別是腫瘤的確診和分型中被廣泛應(yīng)用。然而，目前尚無(wú)可應(yīng)用于臨床診斷的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異抗原的抗體，因此新標(biāo)準(zhǔn)中也沒有涉及免疫組織化學(xué)在結(jié)核病診斷中應(yīng)用的內(nèi)容。結(jié)核病免疫組織化學(xué)染色主要使用兩種類型的抗體。第一種類型是針對(duì)不同細(xì)胞類型的抗體。如抗CD68抗體可以幫助區(qū)分類上皮細(xì)胞與上皮來(lái)源細(xì)胞，有助于確認(rèn)肉芽腫結(jié)構(gòu)，但對(duì)于結(jié)核病的診斷沒有很大幫助。第二種類型是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異抗原的抗體。這類抗體可以在組織切片中顯示結(jié)核分枝桿菌蛋白的表達(dá)，對(duì)協(xié)助結(jié)核病診斷很有幫助。目前，報(bào)道的抗體主要識(shí)別BCG成分、MPT64、PstS1、Ag85B等抗原[13-14]。Ag85B抗原是結(jié)核分枝桿菌最主要的分泌蛋白，在結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有研究報(bào)道，Ag85B免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)核感染的敏感度為53.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗酸染色(34.4%)。Che等[15]報(bào)道了一種新的抗酸染色-免疫組織化學(xué)(Z-C)染色法，通過(guò)同時(shí)進(jìn)行抗酸染色和檢測(cè)Ag85B抗原，其敏感度達(dá)到了65.6%，優(yōu)于單獨(dú)的抗酸染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果。適配體是一種能夠特異性結(jié)合蛋白、細(xì)胞和細(xì)菌的核酸序列，Thakur等[16]基于MPT64抗原，設(shè)計(jì)了一段核酸適配體，能夠有效地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染，特異度和敏感度均很高。結(jié)核分枝桿菌特異性抗體的研發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化可能是未來(lái)結(jié)核病診斷和治療的一個(gè)熱點(diǎn)。

肺結(jié)核的鑒別診斷

非結(jié)核分枝桿菌是分枝桿菌屬中除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外其他分枝桿菌的統(tǒng)稱[17]。非結(jié)核分枝桿菌肺病臨床表現(xiàn)酷似肺結(jié)核，多繼發(fā)于慢性肺病或者免疫缺陷疾病。其組織病理學(xué)基本改變類似于結(jié)核病，抗酸染色均為陽(yáng)性，形態(tài)也非常相似。但非結(jié)核分枝桿菌肺病的組織學(xué)改變以類上皮細(xì)胞肉芽腫改變多見，無(wú)明顯干酪樣壞死。膠原纖維增生且多呈玻璃樣變，這是與結(jié)核病組織學(xué)改變區(qū)別的主要特點(diǎn)。如要明確分枝桿菌的類型，需要進(jìn)行分子病理學(xué)檢測(cè)或新鮮組織培養(yǎng)。

真菌病是除了分枝桿菌病以外最為常見的感染性肉芽腫疾病，HE常規(guī)切片結(jié)合特殊染色可以進(jìn)行很好的鑒別。寄生蟲感染也可引起肉芽腫病變，但是病原蟲體積大，不需要特殊染色，在HE常規(guī)切片中就可以清楚識(shí)別。麻風(fēng)分枝桿菌可形成肉芽腫，亦可形成結(jié)核樣結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)中心可見壞死?？顾崛旧稍诹鲂秃徒缇€型麻風(fēng)病變中查見大量麻風(fēng)分枝桿菌；但在結(jié)核型和未定型麻風(fēng)病變中麻風(fēng)分枝桿菌非常少，明確診斷需通過(guò)基因檢測(cè)進(jìn)行菌種鑒定。其他一些非感染性肉芽腫疾病，如結(jié)節(jié)病、肉芽腫性血管炎和嗜酸性肉芽腫血管炎等，均可通過(guò)抗酸染色及結(jié)核分枝桿菌DNA檢測(cè)加以鑒別[18-20]。應(yīng)該引起注意的是，肺結(jié)核常常并發(fā)肺部腫瘤，在肺結(jié)核發(fā)病的基礎(chǔ)上，肺癌的診治平均延誤時(shí)間為3～18個(gè)月，此時(shí)應(yīng)該綜合影像學(xué)和病理學(xué)方法進(jìn)行甄別，以免延誤腫瘤的治療[21]。

展 望

近年來(lái)，結(jié)核病的發(fā)病特點(diǎn)和流行趨勢(shì)均發(fā)生了很大的變化，耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使全球抗結(jié)核的防治形勢(shì)日益嚴(yán)峻。結(jié)核病的早期診斷和精準(zhǔn)治療至關(guān)重要，病理學(xué)診斷在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。肺結(jié)核診斷新標(biāo)準(zhǔn)中顯著提高了病理學(xué)檢測(cè)在肺結(jié)核診斷和治療中的地位，采用分子病理學(xué)技術(shù)可以快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染和檢測(cè)其耐藥性。然而目前仍存在許多問(wèn)題，比如臨床上仍沒有敏感度與特異度十分滿意的可用于結(jié)核感染檢測(cè)的特異性抗體。相信隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，將會(huì)給結(jié)核病病理學(xué)診斷帶來(lái)新的契機(jī)。

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