三七皂苷組方對(duì)家兔血漿t-PA、PAI-1活性的影響

曾偉成 黃 穎 許光輝

（廈門(mén)市醫(yī)藥研究所，福建 廈門(mén) 361008）

三七的主要成分為皂甙，從三七的不同部位分離的皂甙成分有60余種，其中所含人參皂甙有15種左右。三七具有良好的止血、活血化瘀雙向調(diào)節(jié)藥理作用，雙向調(diào)節(jié)功效是其所含多種活性成分綜合作用所致[1]。我們?cè)谇懊娴难芯恐邪l(fā)現(xiàn)三七總皂苷的不同分離組分對(duì)凝血酶和尿激酶活性的影響情況不同[2]，某些組分可以增強(qiáng)凝血酶或尿激酶活性，另一些組分則可以抑制凝血酶或尿激酶活性。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)弄清三七皂苷各組分作用機(jī)制，將有助于對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)的理解。實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明血漿中組織型纖溶酶原激化物（tissue type plasminogen

activator，t-PA）和纖溶酶原激活物抑制劑（type 1 plasminogen activator inhibitor，PAI-1）水平與血栓形成相關(guān)；三七皂苷Rg1在體內(nèi)外對(duì)家兔血小板PAI-1活性及血漿t-PA和PAI-1活性有影響[3]。本文著重檢測(cè)三七皂苷的不同分離組分對(duì)家兔血漿t-PA和PAI-1活性的影響，篩選出可能對(duì)治療心血管疾病有較好療效的藥方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑：ELISA試劑盒：兔子組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）（購(gòu)自R&D），纖溶酶原抑制劑（PAI-1）（購(gòu)自R&D）；三七總皂苷、人參皂苷Rg1購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，三七皂苷配方組由本所天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備；健康家兔，雄性，體質(zhì)量2.5 kg，廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 儀器：酶標(biāo)儀（ELX800，美國(guó)BIO-TEK公司）；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS5，美國(guó)熱電thermo公司）；電子天平（BL310，德國(guó)Sartorius公司）；離心機(jī)（ROTINA420，德國(guó)Hettich公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備精確稱(chēng)取三七總皂苷粉末8.00 g放于500 mL的燒杯中，加入甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑按一定比例混合形成的溶液100 mL，用玻璃棒不斷攪拌，生成黃色黏稠物質(zhì)后靜置一段時(shí)間，倒出上清液于另一燒杯中，上清液用水浴鍋蒸干，真空干燥得到的固體標(biāo)記為組分A。剩下的固體真空干燥后標(biāo)記為組分B。按上述方法繼續(xù)稱(chēng)取三七總皂苷，按另外比例重新組合甲醇和乙酸乙酯混合液100 mL浸提，得到上清液組分C和沉淀物D。從組分B可繼續(xù)分離得到組分E。這些分離得到的三七皂苷組分A、B、C、D和E中分別加入一定量的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等單體，組合成三七皂苷新配方。取三七總皂苷及新三七總皂苷新配方的干燥粉末分別在傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，對(duì)紅外光譜圖譜圖進(jìn)行比較分析。

1.2.2 血漿制備：3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，心臟采血，低溫1000 r/min離心10 min，小心吸取上層血漿于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

三七皂苷Rg1、實(shí)驗(yàn)中分離得到的各三七皂苷成分按一定比例重新配合，形成5個(gè)新的三七皂苷混合物。三七皂苷對(duì)家兔血漿PAI-1和t-PA活性的影響實(shí)驗(yàn)共分為7個(gè)組別進(jìn)行。組①為空白對(duì)照組，組②-⑥為三七皂苷配方組，組⑦為三七總皂苷。稱(chēng)取三七總皂苷及新組方各10 mg用1 mL的PBS溶解，然后各取0.1 mL加入到1 mL的血漿中，PBS作空白對(duì)照，均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。上述制備的血漿樣品在37 ℃溫育45 min，5000 r/min離心5 min，吸取上清液使用酶標(biāo)儀按試劑盒步驟應(yīng)用雙抗夾心法測(cè)定標(biāo)本中兔血清t-PA、PAI-1水平。450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此計(jì)算血漿中t-PA和PAI-1的濃度。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 三七皂苷對(duì)家兔血漿t-PA活性的影響：結(jié)果顯示:新組合形成的5個(gè)配方和三七總皂苷組相比較，三七皂苷配方④明顯提高血漿t-PA活性（P＜0.01），三七皂苷配方⑥降低血漿t-PA的活性（P＜0.01）。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 三七皂苷對(duì)家兔血漿PAI-1活性的影響：新組合形成的5個(gè)配方和三七總皂苷比較，三七皂苷配方③明顯降低血漿PAI-1活性（P＜0.01），其余組分PAI-1含量變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 圖3給出了三七總皂苷和三七皂苷新配方②號(hào)紅外譜圖，通過(guò)紅外光譜儀QCheck功能顯示出二者的相似度為0.9。從高精度QCheck的分析結(jié)果，可以比較清晰的看出三七總皂苷與三七皂苷新配方②號(hào)之間存在差異，即二者所含成分相似，但是某些成分的含量存在差別。

圖3 三七總皂苷和三七皂苷新配方②號(hào)紅外光譜圖（3000～2800 cm-1范圍）

3 討 論

t-PA是纖溶系統(tǒng)的啟動(dòng)因子，評(píng)估血管功能的指標(biāo)之一即有測(cè)定血漿中t-PA抗原[4]。PAI-1為t-PA的生理快速抑制劑，PAI-1過(guò)多或是過(guò)少都沒(méi)有益處，PAI-1過(guò)多會(huì)使活性纖溶酶生成減少，使得纖維蛋白降解減少，從而導(dǎo)致血栓形成；但是PAI-1活性過(guò)弱則會(huì)引起凝血障礙。所以，適量的PAI-1是纖溶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子，它能夠與纖溶酶原激活物t-PA進(jìn)行結(jié)合，快速失去活性從而發(fā)揮抗纖溶系統(tǒng)的作用，以此來(lái)保持纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)在人體正常血液中的動(dòng)態(tài)平衡。已有文獻(xiàn)報(bào)道傳統(tǒng)藥物可能通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮凝血纖溶物質(zhì)的影響，降低PAI-1的上升；增加主動(dòng)脈組織t-PA的表達(dá)，恢復(fù)纖溶系統(tǒng)的平衡狀態(tài)[5]；根據(jù)我們已做的三七皂甙對(duì)凝血酶和尿激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，不同的三七皂甙對(duì)凝血酶和尿激酶產(chǎn)生的影響有很大的區(qū)別，可以推測(cè)不同的皂苷單體對(duì)t-PA、PAI-1的活性也有著不一樣的作用。在三七總皂甙中各皂甙單體含量是固定的，因而它在功能上是不變的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)三七總皂甙各皂甙單體含量進(jìn)行調(diào)整，使得新的配方在抑制或激活t-PA、PAI-1功能上有所加強(qiáng)，但仍保持一定的雙向調(diào)節(jié)能力。篩選出的三七皂苷配方④號(hào)能明顯提高家兔血漿t-PA活性，三七皂苷配方③號(hào)明顯降低血漿PAI-1活性，新的三七皂苷配方配方是三七總皂苷的加強(qiáng)版，用于抗血栓治療效力更強(qiáng)。因此，優(yōu)選出的配方用于心血管疾病的治療會(huì)更有針對(duì)性。

[1] 王興文.水提三七總皂苷[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,24(3):1-3.

[2] 曾偉成,黃穎,楊輝.三七總皂苷及分離成分對(duì)尿激酶和凝血酶活性的影響[J].福建醫(yī)藥雜志,2013,35(2):77-79.

[3] 詹合琴,李平法,楊錦南,等.三七皂苷Rg1對(duì)t-PA和PAI-1水平的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2006,22(7):869-872.

[4] 李衛(wèi)征,高重陽(yáng).急性腦梗死患者血漿t-PA及PAI-1的變化及意義[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師,2014,30(7):96-99.

[5] 郝薔薇,麻春杰,曾寒泊,等.額爾敦-烏日勒對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊家兔凝血纖溶物質(zhì)t-PA、PAI-1、Fbg的影響[J].中藥新藥與臨床藥理2015,26(6):778-781.