大孔吸附樹脂分離純化辣蓼總黃酮研究

宋漫玲++陶俊宇++楊劍++胡庭俊

摘要：目的 采用大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼總黃酮進(jìn)行分離純化，探討靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附過程中多種因素對(duì)吸附及解吸效果的影響，以確定其最佳分離提純工藝。方法 提取辣蓼總黃酮，測定辣蓼黃酮乙酸乙酯部位（FEA）與辣蓼黃酮正丁醇部位（FNB）黃酮含量，進(jìn)行大孔吸附樹脂對(duì)FEA與FNB的吸附試驗(yàn)，采用D101、AB-8、DM130和XDA-8大孔樹脂優(yōu)選最佳分離純化工藝。結(jié)果 選擇XDA-8進(jìn)行辣蓼總黃酮的富集，其最佳工藝為：調(diào)節(jié)FEA黃酮pH值為6，上樣濃度為750 μg/mL，用75%乙醇洗脫，以1 BV/h流速洗脫5 BV；調(diào)節(jié)FNB黃酮pH值為6.0，上樣濃度為1 mg/mL，用60%乙醇洗脫，以1 BV/h流速洗脫5 BV。結(jié)論 采用XDA-8大孔吸附樹脂通過最佳工藝有利于分離純化辣蓼總黃酮。

關(guān)鍵詞：大孔吸附樹脂；辣蓼總黃酮；分離純化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.016

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）01-0074-05

Study on Separation and Purification of Total Flavonoids from

Polygonum hydropiper Linn. by Macroporous Resin

SONG Man-ling1， TAO Jun-yu2， YANG Jian1， HU TING-jun1

1. School of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China；

2. School of Preclinical Medicine， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China

Abstract： Objective To study the separation and purification of total flavonoids from Polygonum hydropiper Linn. by macroporous adsorption resin； To investigate the effects of various factors in the process of static and dynamic adsorption on effects of adsorption and desorption to determine the optimum capability. Methods The total flavonoids from Polygonum hydropiper Linn. was extracted； the contents of flavonoids of ethyl acetate part （FEA） and flavonoids of n-butanol part （FNB） were detected； the adsorption experiment of FEA and FNB was conducted by macroporous adsorption resin. D101， AB-8， DM130， and XDA-8 macroporous resin were used to optimize the separation and purification process. Results The XDA-8 macroporous resin was selected to enrich total flavonoids from Polygonum hydropiper Linn. The optimum process was： adjusting the pH value of FEA flavonoids to 6， the concentration of sample was 750 g/mL， eluting with 75% ethanol to elute 5 bed volumes at a flow rate of 1 bed per hour； adjusting the pH value of FNB flavonoids to 6， the concentration of sample was 1 mg/mL， eluting with 60% ethanol to elute 5 bed volumes at a flow rate of 1 bed per hour. Conclusion XDA-8 macroporous adsorption resin is helpful to separate and purify the total flavonoids of Polygonum hydropiper Linn. by the best process.

Keywords： macroporous adsorption resin； Polygonum hydropiper Linn.； total flavonoids； separation and purification

辣蓼為蓼科蓼屬植物水蓼Polygonum hydropiper L.的全草，其主要成分為鞣質(zhì)、黃酮和揮發(fā)油，其中黃酮類化合物有蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、異鼠李素[1]。近年研究表明，黃酮類化合物具有良好的抗菌[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]生理活性，還能降血壓[5]、

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31560708）endprint

通訊作者：胡庭俊，E-mail：tingjunhu@126.com.

降血脂[6]和提高機(jī)體免疫力[7]。大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，近年來被廣泛運(yùn)用于中草藥有效成分的分離及新藥的開發(fā)與研制，其具有價(jià)格便宜、穩(wěn)定性高、吸附快、吸附容量大、洗脫率高、解吸條件溫和、再生簡便、使用周期長等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)應(yīng)用大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼總黃酮進(jìn)行分離純化，探討靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附過程中多種因素對(duì)吸附及解吸效果的影響，為開發(fā)利用辣蓼提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI），V-700真空泵（BUCHI），超聲波清洗機(jī)（SB-5200DTDN，寧波新芝生物科技股份有限公司），紫外分光光度計(jì)（UV-1750，島津），純水儀（CD-UPT-1，成都純?cè)娇萍加邢薰荆?，分析天平（EL204，METTLER TOLEDO）。D101、DM130、XDA-8、AB-8大孔樹脂，西安藍(lán)曉科技。

辣蓼，南寧市山草堂，批號(hào)20160519，烘干除雜后粉碎備用。蘆丁對(duì)照品，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080-200707。

2 方法與結(jié)果

2.1 辣蓼總黃酮的提取

取辣蓼粉末（過100目篩），按料液比為1∶30與pH 4.8的HAc-NaAc緩沖液混合，加入0.25%纖維素酶與果膠酶，50 ℃超聲處理1.5 h，之后用Na2CO3溶液調(diào)pH至9.0，于85 ℃水浴15 min使酶滅活。加入純乙醇使酶解液中醇濃度為60%，浸提24 h，回收浸提液，濾渣按1∶30料液比再加入60%乙醇溶液重復(fù)浸提1次，過濾，合并2次濾液，濾液經(jīng)過石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取。收集辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與辣蓼黃酮正丁醇部位，減壓蒸干，備用。

2.2 黃酮含量測定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10 mg，加入60%乙醇溶液，充分溶解，并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.2.2 測定波長的選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取蘆丁對(duì)照品溶液（0.2 mg/mL）0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、3.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇至5 mL，加5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻后靜置5 min，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，邊滴入邊搖勻，以60%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后靜置15 min。對(duì)蘆丁對(duì)照品溶液顯色后用1 cm比色皿在波長400～700 nm區(qū)間掃描，確定最大吸收波長。以第1管溶液作空白，分別測定吸光度，以總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 樣品測定

將辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位充分溶解，取樣品液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的顯色程序各取3份進(jìn)行平行測定，記錄最大吸收下的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總黃酮含量。

2.3 大孔吸附樹脂吸附試驗(yàn)

2.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

取一定量樹脂，用無水乙醇浸泡24 h充分溶脹后裝柱。用95%乙醇沖洗，直到流出液加入等體積去離子水無渾濁后用4 BV去離子水洗凈乙醇；用3%鹽酸溶液4 BV沖洗，去離子水沖洗至中性；用3%氫氧化鈉溶液4 BV沖洗，去離子水沖洗至中性。

2.3.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

將預(yù)處理好的大孔吸附樹脂抽濾至不滴水，各精密稱取2.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別準(zhǔn)確加入50 mL辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位，于室溫以120 r/min在搖床中振搖24 h充分吸附，取上清液，用0.22 ?m濾膜過濾，濾液用分光光度計(jì)測定剩余黃酮含量，計(jì)算各大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量。

2.3.3 靜態(tài)解吸試驗(yàn)

取上述已吸附飽和的樹脂，分別加入95%乙醇50 mL，于室溫以120 r/min在搖床中振搖24 h，使大孔吸附樹脂解吸完全，取上清液，用分光光度計(jì)測定其中蘆丁和黃酮的含量，計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附量、靜態(tài)解吸量及靜態(tài)解吸率。靜態(tài)吸附量（mg/g）=V藥液×（C0-C1）/M，靜態(tài)解吸量（mg/g）=V洗脫液×C2/M，靜態(tài)解吸率（%）=靜態(tài)解析量÷靜態(tài)吸附量×100%。式中，C0為黃酮初始濃度（mg/mL），C1為黃酮剩余濃度（mg/mL），C2為洗脫液中黃酮濃度（mg/mL），M為樹脂質(zhì)量（g）。

用4種大孔樹脂分別對(duì)辣蓼黃酮乙酸乙酯部位和正丁醇部位進(jìn)行吸附與解吸，結(jié)果見表1～表3。XDA-8大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位不僅有較大的靜態(tài)吸附量，而且有較大的靜態(tài)解析量。

2.3.4 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測定

準(zhǔn)確移取辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位50 mL，加入盛有4種大孔樹脂的錐形瓶內(nèi)，置恒溫振蕩器上振蕩（30 ℃、120 r/min），每隔一段時(shí)間取1 mL溶液測定，連續(xù)測定8 h，計(jì)算樹脂對(duì)辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位的吸附量，確定吸附量與時(shí)間的關(guān)系，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線（見圖1、圖2），研究其吸附速率。由圖可知，XDA-8大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮都有良好的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性，能在4 h內(nèi)達(dá)到吸附平衡，與其他大孔吸附樹脂相比，更適合進(jìn)行試驗(yàn)性研究與工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3.5 大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位的動(dòng)態(tài)吸附分離特性研究

通過大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，優(yōu)選出1種樹脂進(jìn)行上樣液濃度、上樣液pH值、洗脫液濃度與用量等影響因素的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。將預(yù)處理好的大孔吸附樹脂裝入玻璃層析柱（1.6 cm×40 cm）中，將辣蓼黃酮乙酸乙酯部位與正丁醇部位上柱，控制一定流速，按5 mL為一部分收集流出液，測定流出液中黃酮含量。endprint

2.3.5.1 上樣液濃度的影響

將辣蓼黃酮乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮配制成黃酮濃度為0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mg/mL待上樣溶液25 mL。以1 BV/h速度加入裝有180 mL XDA-8樹脂的層析柱內(nèi)（2 cm×60 cm，樹脂柱床高約50 cm）進(jìn)行吸附，靜止吸附3 h后，用2 BV蒸餾水除雜，用95%乙醇以2 BV/h速度進(jìn)行洗脫，計(jì)算吸附量。上樣量濃度與吸附量的關(guān)系見圖3。由圖可知，用XDA-8大孔樹脂分離純化辣蓼黃酮乙酸乙酯部位的最佳上樣濃度為750 μg/mL，正丁醇部位的最佳上樣濃度為1.0 mg/mL。

2.3.5.2 上樣液pH值的影響

將辣蓼乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮（黃酮濃度為0.75 mg/mL）配制成pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的待上樣溶液25 mL，以1 BV/h速度加入加入裝有XDA-8樹脂180 mL的層析柱內(nèi)（2 cm×60 cm，樹脂柱床高約50 cm）進(jìn)行吸附，靜止吸附3 h后，用2 BV蒸餾水除雜。用95%乙醇100 mL以2 BV/h速度進(jìn)行洗脫，計(jì)算吸附率。上樣液pH值與吸附率的關(guān)系見圖4。由圖可知，用XDA-8大孔樹脂分離純化辣蓼黃酮乙酸乙酯和正丁醇部位，其上樣液最佳pH值均為6.0。

2.3.5.3 XDA-8大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)累積泄漏曲線

將辣蓼黃酮乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮（黃酮濃度為0.75 mg/mL）以1 BV/h速度加入裝有XDA-8樹脂180 mL的層析柱內(nèi)（2 cm×60 cm，樹脂柱床高約50 cm）進(jìn)行吸附。收集流出液，測定每份滲出液中總黃酮濃度，以流出液中總黃酮濃度為上樣液總黃酮濃度的1/10為泄漏點(diǎn)。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)、黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖5。由圖可知，用XDA-8大孔吸附樹脂分離純化辣蓼總黃酮，對(duì)于乙酸乙酯部位黃酮，5 BV時(shí)達(dá)到泄漏點(diǎn)，50 BV時(shí)達(dá)到飽和；對(duì)于正丁醇部位黃酮，10 BV時(shí)達(dá)到泄漏點(diǎn)，50 BV時(shí)達(dá)到飽和。

2.3.5.4 洗脫劑濃度的影響

將25 mL pH值為6的辣蓼黃酮乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮（黃酮濃度為0.75 mg/mL）以1 BV/h速度加入裝有XDA-8樹脂180 mL的層析柱內(nèi)（2 cm×60 cm，樹脂柱床高約50 cm）進(jìn)行吸附，分別用蒸餾水（0%）及15%、30%、45%、60%、75%、90%乙醇各10 BV進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并測定其中黃酮含量，計(jì)算洗脫率，結(jié)果見圖6。由圖可知，用XDA-8大孔樹脂分離純化辣蓼黃酮，對(duì)于乙酸乙酯部位最佳洗脫劑為75%乙醇，洗脫率為92%；對(duì)于正丁醇部位最佳洗脫劑為60%乙醇，洗脫率為90%。

2.3.5.5 洗脫曲線的繪制

精密吸取25 mL pH值為6的辣蓼黃酮乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮（黃酮濃度為0.75 mg/mL）以1 BV/h速度加入裝有XDA-8大孔樹脂180 mL的層析柱內(nèi)（2 cm×60 cm，樹脂柱床高約50 cm）進(jìn)行吸附，靜置吸附4 h后，用最佳洗脫濃度乙醇以2 BV/h流速進(jìn)行洗脫，按柱床體積收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮濃度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖7?？梢?，用XDA-8大孔樹脂分離純化辣蓼黃酮，用75%乙醇洗脫乙酸乙酯部位黃酮，用60%乙醇洗脫正丁醇部位黃酮，5 BV洗脫劑能將辣蓼黃酮基本洗脫下來。

3 討論

大孔樹脂是一種有機(jī)高分子吸附材料，其利用氫鍵和范德華力作用及多孔結(jié)構(gòu)對(duì)分子大小不同的物質(zhì)的選擇性吸附作用來達(dá)到分離提純效果。根據(jù)樹脂的吸附性能和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)，本試驗(yàn)選用了弱極性的D101、AB-8、DM130和極性的XDA-8樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸解量和靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測定，發(fā)現(xiàn)極性的XDA-8大孔吸附樹脂對(duì)辣蓼黃酮乙酸乙酯部位黃酮與正丁醇部位黃酮都有良好的靜態(tài)解吸效果和靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性，表明應(yīng)用XDA-8大孔吸附樹脂更有利于分離純化辣蓼黃酮，其成本低、工藝簡單，適合試驗(yàn)和生產(chǎn)。

雖然應(yīng)用大孔吸附樹脂可改變中藥傳統(tǒng)提取中“黑、大、粗”的缺點(diǎn)，但試驗(yàn)過程中有機(jī)溶劑（苯、甲苯、對(duì)二甲苯等）殘留是不容忽視的問題，需妥善處理。試驗(yàn)前對(duì)大孔吸附樹脂的處理也非常關(guān)鍵，為避免樹脂殘留物影響被提取藥物的安全性，應(yīng)將樹脂洗脫至中性，保證樹脂安全，使后續(xù)試驗(yàn)得以順利進(jìn)行。其次，在試驗(yàn)中先用石油醚和氯仿萃取除去葉綠素等雜質(zhì)，可以使后續(xù)的大孔吸附樹脂分離純化更容易進(jìn)行。此外，溫度對(duì)XDA-8大孔吸附樹脂分離純化辣蓼黃酮也存在一定影響，在一定范圍內(nèi)升高溫度，有助于吸附辣蓼黃酮。

運(yùn)用大孔樹脂富集黃酮的報(bào)道最早用于銀杏葉中，在經(jīng)過XAD7HP大孔樹脂純化后總黃酮含量顯著升高[8]。近年來，有關(guān)辣蓼中黃酮類物質(zhì)的提取工藝鮮有報(bào)道，而關(guān)于其黃酮化合物的純化工藝更少。本試驗(yàn)確定了XDA-8大孔吸附樹脂分離純化辣蓼總黃酮的最佳工藝為：調(diào)節(jié)乙酸乙酯部位黃酮pH值為6.0，上樣濃度為750 μg/mL，用75%乙醇洗脫，以1 BV/h流速洗脫5 BV；調(diào)節(jié)正丁醇部位黃酮pH值為6.0，上樣濃度為1 mg/mL，用60%乙醇洗脫，以1 BV/h流速洗脫5 BV。

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（收稿日期：2017-04-21）

（修回日期：2017-06-26；編輯：陳靜）endprint