進(jìn)一步重視脊髓損傷的基礎(chǔ)與臨床研究

李忠海 呂德成

全球每年因外傷性脊髓損傷 ( spinal cord injury，SCI ) 而喪失肢體感覺、運(yùn)動功能的病例數(shù)高達(dá) 60 多萬，已呈現(xiàn)高發(fā)生率、高致殘率、高耗費(fèi)和低齡化的“三高一低”的局面，SCI 后的神經(jīng)修復(fù)已成為醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的重大挑戰(zhàn)和臨床難題。我國現(xiàn)有創(chuàng)傷性 SCI 患者超過 200 萬，并且每年新增 10～14 萬人，給家庭和社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。近年來，挽救受損神經(jīng)元，促進(jìn)受損神經(jīng)元軸突的再生，再生軸突與靶組織形成正確的突觸聯(lián)系，以及脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)等研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，這方面的基礎(chǔ)研究令人鼓舞，我國在 SCI 領(lǐng)域也取得了一定的進(jìn)步，尤其是跨界學(xué)科的發(fā)展，給 SCI 的綜合治療提供了新的思路[1-3]。如何立足于實(shí)驗(yàn)室成果，將其更好地運(yùn)用于臨床，最終使患者受益，仍是廣大學(xué)者面臨的巨大挑戰(zhàn)[4]。因此，進(jìn)一步重視 SCI 的基礎(chǔ)與臨床研究具有必要性、迫切性和戰(zhàn)略性。

一、SCI 后微環(huán)境的修復(fù)與構(gòu)建

SCI 后經(jīng)歷原發(fā)性和繼發(fā)性損傷的序貫過程，造成不同程度的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞壞死、凋亡以及軸突斷裂和脫髓鞘。原發(fā)性損傷是物理打擊直接造成的，隨后出現(xiàn)細(xì)胞膜裂解、血管損傷、出血、局部缺血以及栓塞，是源于神經(jīng)纖維、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜以及血管的機(jī)械性破壞，造成以損傷中心區(qū)域出血性壞死為特征的損害，并可擴(kuò)大為繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是序貫性生物瀑布激活所導(dǎo)致的凋亡以及興奮性氨基酸毒性的損傷所致，損傷后一些從血管中溢出的血液成分，會在隨后的幾天中成為巨噬細(xì)胞活動等免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，引發(fā)瀑布式級聯(lián)反應(yīng)：包括水腫、炎癥反應(yīng)、局部缺血、谷氨酸受體過度激活所致的興奮性氨基酸中毒、脂質(zhì)過氧化作用、鈣離子超載、細(xì)胞因子及凋亡、自由基損傷與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、一氧化氮 / 一氧化氮合酶 ( NO / NOS ) 神經(jīng)毒性作用等。脊髓的繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致感覺和運(yùn)動功能喪失的主要原因，由于神經(jīng)元相對脆弱，其對微環(huán)境中因素的變化較為敏感，因此在研究中應(yīng)當(dāng)重視這些因素所帶來的影響，通過外源性輔助性細(xì)胞或細(xì)胞因子、相應(yīng)藥物或其它方式調(diào)整和修復(fù)神經(jīng)元生存微環(huán)境，使之有利于脊髓修復(fù)，這是SCI 治療的重要手段之一。

中樞神經(jīng)細(xì)胞再生受到內(nèi)因和外因的影響。內(nèi)因是指通過使用神經(jīng)營養(yǎng)素 ( neurotrophins，NT ) 家族和神經(jīng)營養(yǎng)因子 [ 以膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 ( glial cell derived neurotrophic factor，GDNF ) 為代表 ] 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和加強(qiáng)其再生能力。外因是指改善細(xì)胞外部條件，例如從對抗髓內(nèi)抑制性蛋白等方面來開展。使用外源性輔助性細(xì)胞 [ 例如中樞神經(jīng)系統(tǒng) ( central nervous system，CNS ) 的嗅鞘細(xì)胞 ( olfactory ensheathing cells，OECs ) 和外周神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺細(xì)胞 ] 促進(jìn)髓鞘再生以及使用外源性神經(jīng)生長因子 ( 例如 Trk 家族激動劑類 ) 促進(jìn)神經(jīng)再生是微環(huán)境修復(fù)的兩個重要方向。馮世慶等[5]使用基因工程手段將二者結(jié)合在一起，證明高表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 ( brain derived neurotrophic factor，BDNF ) 或神經(jīng)生長因子 ( neuron growth factor，NGF )的雪旺細(xì)胞促神經(jīng)再生功能作用比普通雪旺細(xì)胞更為明顯。這些經(jīng)過體外修飾的雪旺細(xì)胞移植入脊髓后不僅能填充損傷空洞、促進(jìn)神經(jīng)再生和軸突再髓鞘化，而且能減少膠質(zhì)傷疤形成，降低神經(jīng)再生障礙發(fā)生率。何成等[6]研究指出 OECs 的遷徙能力與其促進(jìn)神經(jīng)軸突再生能力有關(guān)，其中腫瘤壞死因子 α ( tumor necrosis factor α，TNFα ) 和 GDNF 均能促進(jìn) OECs 向損傷區(qū)域遷徙，而抑制分子受體 ( Nogo-66 receptor，NgR ) 則抑制其遷徙，提示 OECs 促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的能力還能進(jìn)一步挖掘。游思維等[7]指出 OECs 與雪旺細(xì)胞相比，能與星形膠質(zhì)細(xì)胞有更好的整合，通過減輕炎癥反應(yīng)和組織破壞，OECs 在抑制膠質(zhì)瘢痕形成上具有更加獨(dú)到的作用。

在 SCI 的發(fā)生發(fā)展中，多因素炎癥反應(yīng)過程是導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的重要因素，其病理性炎癥環(huán)境涉及多種復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制。SCI 后炎癥反應(yīng)具有兩面性，既是機(jī)體對損傷因素的積極應(yīng)答，也是造成脊髓繼發(fā)性病理損傷的關(guān)鍵因素。SCI 后炎癥反應(yīng)主要由 CNS 活化的膠質(zhì)細(xì)胞和外周來源的免疫細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧和第二信使調(diào)節(jié)，是免疫、生化、病理生理過程共同作用的結(jié)果，嚴(yán)重程度取決于原發(fā)性損傷的機(jī)制及繼發(fā)性損傷的病理過程[8-10]。炎癥反應(yīng)的急性期以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞入侵脊髓受損區(qū)域?yàn)樘卣鳎云谝粤馨图?xì)胞介導(dǎo)為主。膠質(zhì)細(xì)胞對 SCI 反應(yīng)迅速，在數(shù)小時內(nèi)即可上調(diào)炎性因子表達(dá)，因此可以將SCI 后炎癥病理過程作為干預(yù)靶點(diǎn)，這為 SCI 的治療提供了新的方向。

水腫是脊髓繼發(fā)性損傷的重要病理過程，受損神經(jīng)元內(nèi)部離子通道的開放和膠質(zhì)細(xì)胞外源性水通道蛋白的釋放都參與組織水腫過程。離子通道蛋白 1 ( Na-K-Cl cotransporter 1，NKCC1 ) 被認(rèn)為是神經(jīng)元細(xì)胞水腫的關(guān)鍵影響因子，而水通道蛋白家族 ( aquaporins，AQPs ) 是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)控水分子平衡的重要信號蛋白。研究發(fā)現(xiàn) NKCC1 在 CNS 神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中都存在廣泛表達(dá)，在中樞神經(jīng)損傷后組織內(nèi) NKCC1 表達(dá)量增高，而使用布美他尼抑制 NKCC1 后，p-Erk 水平降低，能夠減輕神經(jīng)元凋亡[11]。

亞低溫治療能夠通過降低氧耗量、改善腦血流、減輕腦水腫等途徑改善受損組織微環(huán)境，具有獨(dú)特的神經(jīng)保護(hù)作用。然而在亞低溫環(huán)境中，普通干細(xì)胞的活性很低，難以充分發(fā)揮保護(hù)作用。張賽等[12]通過將溫度敏感型猿猴病毒抗原引進(jìn)導(dǎo)入至臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 ( mesenchymal stem cells，MSCs ) 中，建立了溫敏臍帶MSCs，實(shí)現(xiàn)了亞低溫概念與溫敏干細(xì)胞治療相結(jié)合，其優(yōu)點(diǎn)是將溫敏干細(xì)胞最大增殖活性的溫度與亞低溫治療的最適溫度相契合，為損傷急性期移植提供可行性，及時挽救變性的神經(jīng)細(xì)胞。

酸中毒在 SCI 過程中比較常見，但是其具體機(jī)制仍不得而知。馮華等[13]認(rèn)為脊髓神經(jīng)元上酸敏感性離子通道 1a ( acid-sensing ionic channels 1a，ASIC1a ) 在繼發(fā)損傷中具有重要的作用。在脊髓繼發(fā)性損傷中，ASIC1a 及其引起的鈣內(nèi)流都顯著增高，提示酸中毒有可能是引起神經(jīng)元鈣超載損傷的重要原因之一。

二、SCI 后軸突再生與神經(jīng)環(huán)路的重建

神經(jīng)再生及神經(jīng)環(huán)路的重建是 SCI 治療最終要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)，也是最重要的科學(xué)問題。目前研究認(rèn)為，單純依靠內(nèi)源性神經(jīng)再生不能夠滿足恢復(fù)受損神經(jīng)環(huán)路的要求，而外源性的細(xì)胞替代、組織功能橋接和小分子化合物的使用能夠更大程度地實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

干細(xì)胞治療在重新構(gòu)筑損傷脊髓和促進(jìn)功能恢復(fù)方面已經(jīng)展現(xiàn)出了巨大的潛力，然而其在臨床應(yīng)用中仍存在著許多問題[14-16]。胚胎干細(xì)胞 ( embryonic stem cells，ESCs ) 因?yàn)閬碓吹膫惱韱栴}及移植后的致瘤性問題等限制了其臨床應(yīng)用；誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 ( induced pluripotent stem cells，iPSCs ) 來源于自體細(xì)胞的重編程，雖然沒有倫理問題，但因外源性基因?qū)?，其臨床應(yīng)用也存在著有效性和安全性的問題；MSCs 沒有倫理爭議且來源廣泛，在抑制炎性細(xì)胞活化、重構(gòu)局部血供系統(tǒng)以及分泌促神經(jīng)再生因子方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，但由于其分化潛能弱于其分泌潛能，在治療細(xì)胞缺失嚴(yán)重的慢性 SCI 中不是最佳備選細(xì)胞；不同來源的MSCs 其生物學(xué)特性不盡相同，對于晚期 SCI 的治療應(yīng)用 MSCs 不是理想選擇。

生物材料、種子細(xì)胞和信號分子是構(gòu)建具有促進(jìn)體內(nèi)組織再生功能組織材料的三要素。在使用組織功能技術(shù)進(jìn)行 SCI 治療的過程中，應(yīng)該選擇適合損傷修復(fù)的不同理化屬性及不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的支架材料，并對支架材料進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)及生物相容性改造，創(chuàng)造更適合種子細(xì)胞生存和神經(jīng)環(huán)路重建的微環(huán)境[17-19]。我國科學(xué)家在生物支架材料結(jié)合再生因子構(gòu)建 SCI 微環(huán)境研究中也取得長足進(jìn)展，比如利用殼聚糖支架搭載 NT3 的復(fù)合生物材料促進(jìn)成年內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生修復(fù) SCI，避免了倫理糾紛、免疫排斥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生的風(fēng)險，同時借助轉(zhuǎn)錄本分析揭示了 SCI 修復(fù)的分子機(jī)理，即 NT3-殼聚糖支架在激活成年內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生的同時，促進(jìn)了血管的生成并抑制了炎癥細(xì)胞的浸潤[20]。2013 年，諾貝爾獎獲得者美國斯坦福大學(xué)教授 Südhof Thomas C 專門撰文對此項(xiàng)研究成果評述。我國學(xué)者還研制出能與膠原材料特異結(jié)合的神經(jīng)再生因子，通過與膠原支架材料特異結(jié)合，構(gòu)建了特異結(jié)合再生因子的智能生物材料，如 CBD-BDNF、CBD-NT3、CBD-NGF、CBD-bFGF、CBD-VEGF，解決了再生因子空間定位和濃度維持的技術(shù)難題，通過大鼠 SCI 模型證實(shí)，該生物材料能夠減少損傷面積擴(kuò)散，引導(dǎo)神經(jīng)纖維有序再生，促進(jìn)神經(jīng)再生及神經(jīng)功能恢復(fù)，并在隨后的比格犬大段缺損全橫斷 SCI 修復(fù)實(shí)驗(yàn)中證明其具有相同的效果，并首次實(shí)現(xiàn)全橫斷 SCI 犬的站立和行走[21]。

三、SCI 再生修復(fù)的臨床轉(zhuǎn)化研究

SCI 屬于尚未解決的重大醫(yī)學(xué)難題。只有按照國際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施臨床試驗(yàn)研究，研究成果才能夠得到國際同行認(rèn)可。我國科學(xué)家在 SCI 臨床試驗(yàn)研究方面做了大量的嘗試。查詢 Clinical trial 網(wǎng)站，目前開展的 SCI 臨床研究中干細(xì)胞結(jié)合生物支架材料臨床研究均為中國注冊，表明我國相關(guān)臨床研究已走在世界前列。2016 年，《Cell Transplantation》發(fā)表了慢性完全性 SCI 的國內(nèi)臨床 I / II 試驗(yàn)結(jié)果，表明臍帶血單核細(xì)胞移植輔助髓內(nèi)減壓和支持行走訓(xùn)練 65% 的患者表現(xiàn)出不同程度的功能恢復(fù)，但是單純細(xì)胞移植患者雖然在影像學(xué)方面出現(xiàn)了脊髓內(nèi)部纖維可塑性變化，但是功能恢復(fù)不明顯[22]?？傮w來說，我國學(xué)者已鑒定出 SCI 微環(huán)境中抑制神經(jīng)軸突生長和神經(jīng)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子，為解釋脊髓神經(jīng)再生困難的原因提供了依據(jù)；通過支架材料、再生因子與干細(xì)胞結(jié)合構(gòu)建 SCI 再生微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，重建脊髓受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)部分 SCI 功能修復(fù)；提出并初步證實(shí)了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和組織工程神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) ( 或類脊髓組織 )形成神經(jīng)元中繼器是完全性 SCI 功能恢復(fù)的主要機(jī)制；開展了生物材料結(jié)合干細(xì)胞治療 SCI 的臨床研究，我國多策略修復(fù) SCI 的臨床研究已走在世界前列，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

總結(jié)已有的臨床研究結(jié)果，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為由于 SCI 后復(fù)雜的微環(huán)境，單一的治療方法效果非常有限，多種策略聯(lián)合應(yīng)用 ( 生物材料、再生因子、干細(xì)胞 ) 被認(rèn)為是促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的一種有效策略[23-25]。但在 SCI臨床研究中尚面臨一些需要解決的問題，比如：由于脊髓休克的存在，目前常用的 ASIA 分級并不完全適合急性 SCI 嚴(yán)重程度的判定，如何判定患者為完全性損傷？陳舊性 SCI 患者損傷區(qū)的瘢痕可抑制神經(jīng)再生，在手術(shù)中如何區(qū)分陳舊性 SCI 的瘢痕組織與未受損傷的脊髓組織，以便清理瘢痕？如何防止 SCI 后外周神經(jīng)和肌肉失用性萎縮等問題亟待解決。

SCI 再生修復(fù)一直是困擾醫(yī)學(xué)界的世界性難題，是影響國家經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的重大科學(xué)問題。神經(jīng)損傷修復(fù)是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，神經(jīng)組織又涵蓋大量不同類型的細(xì)胞，加之損傷后有淋巴系統(tǒng)的侵入以及各類內(nèi)源干細(xì)胞的活化，進(jìn)一步增加了細(xì)胞群體內(nèi)的異質(zhì)性。目前，我國學(xué)者在該領(lǐng)域已取得很大的進(jìn)步，但在取得成績的同時，我們還存在很大的不足，這也給致力于 SCI 領(lǐng)域研究的同道提出了更高的要求和期盼。目前，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多個具有潛力的治療方向已經(jīng)出現(xiàn)，相信在未來隨著相關(guān)研究的深入，會有更多成果運(yùn)用于臨床，為 SCI 患者帶來福音。