高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大豆分離蛋白中的三聚氰胺

常晨陽(yáng) 常凱 朱秀煥 劉偉 韋偉

摘要 本文建立了由高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量準(zhǔn)確、快速檢測(cè)大豆分離蛋白中三聚氰胺的方法。試樣中殘留的三聚氰胺經(jīng)1%三氯乙酸溶液提取，經(jīng)CX固相萃取柱凈化，用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)外標(biāo)法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，檢出限為5 ？滋g/kg。添加水平分別為0.02、0.05、0.10 mg/kg的樣品加標(biāo)回收率為86.7%～101.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%（n=6）。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，適用于大豆分離蛋白中三聚氰胺的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；大豆分離蛋白；三聚氰胺

中圖分類(lèi)號(hào) O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）21-0252-02

大豆分離蛋白是以低溫脫溶大豆粕為原料生產(chǎn)的一種全價(jià)蛋白類(lèi)食品添加劑[1]，外觀呈淡黃色、乳白色粉末狀，其蛋白質(zhì)含量在90%以上，氨基酸種類(lèi)有近20種，并含有人體必需氨基酸。因其營(yíng)養(yǎng)豐富，不含膽固醇，是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動(dòng)物蛋白的品種之一。又因其乳化性、水合性、吸油性、凝膠性、發(fā)泡性、結(jié)膜性等特性，廣泛應(yīng)用在肉類(lèi)制品、乳制品、面制品及蛋白粉等食品中。隨著近年來(lái)大豆分離蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的普及，國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆分離蛋白的需求旺盛，生產(chǎn)企業(yè)及生產(chǎn)數(shù)量規(guī)?；霈F(xiàn)量化增長(zhǎng)趨勢(shì)。

三聚氰胺（melamine，C3H6N6），是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，食用三聚氰胺能誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，是一種禁止用于食品及動(dòng)物飼料中的化學(xué)物質(zhì)。由于三聚氰胺中氮含量高達(dá)66%，較蛋白質(zhì)氨基酸高 3～4倍，添加三聚氰胺可虛假提高蛋白質(zhì)含量，降低成本，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[2]。我國(guó)在“三鹿”事件發(fā)生后將三聚氰胺列入法檢目錄，要求不得在植物源蛋白類(lèi)產(chǎn)品中檢出三聚氰胺。我國(guó)已經(jīng)制定了多個(gè)三聚氰胺檢測(cè)國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[4-6]，其中《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T 22388—2008）和《飼料中三聚氰胺的測(cè)定》（NY/T 1372—2007）為乳制品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，《植物源產(chǎn)品中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》（GB/T 22288—2008）雖為植物源產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但具體使用范圍僅限于小麥粉、玉米粉和大米粉，目前并沒(méi)有明確適用于大豆分離蛋白的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。筆者基于多年來(lái)檢測(cè)出口大豆分離蛋白產(chǎn)品的經(jīng)驗(yàn)，建立了采用高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定大豆分離蛋白中三聚氰胺的方法。該方法準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)，且無(wú)需經(jīng)過(guò)衍生化處理，適用于大豆分離蛋白中三聚氰胺測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器有高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（日本島津有限公司LCMS-8040）、電子天平（瑞士梅特勒ME303）、高速離心機(jī)（日本日立 CF16RXⅡ）、漩渦混合器（德國(guó)IKA MS3 Digital）、氮空吹掃濃縮儀（中國(guó)斯帕特 SPT-24）、固相萃取裝置（中國(guó)楚定DG-24）。

試劑有：乙腈、甲醇，均為色譜純（美國(guó)默克公司）；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度>99.0%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境安全監(jiān)控研究所）；其余化學(xué)試劑為分析純；試驗(yàn)用水為超純水；CX固相萃取小柱（ACS Retain CX，60 mg/3 mL）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.020 0 g三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用50%甲醇水溶解定容至100.0 mL容量瓶中，得到200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確移取500 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相10 mmol/L乙酸銨/乙腈（體積比=4∶6）稀釋定容至100.0 mL，得到1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，再逐級(jí)稀釋成濃度為10、20、50、75、100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 樣品處理

稱(chēng)取試樣（2.5±0.01）g于50 mL離心管中，加入25 mL 1%三氯乙酸，渦旋混勻，在10 000 r/min條件下離心5 min，經(jīng)中速定量濾紙過(guò)濾后收集濾液于新的50 mL離心管中待凈化。預(yù)活化固相萃取CX柱（分別用3 mL甲醇和3 mL水活化），加入10 mL上述濾液，后用3 mL水和3 mL甲醇分別洗滌CX柱子，減壓抽至近干后用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集濾液。濾液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加? mL流動(dòng)相渦旋混勻，過(guò)0.2 μm PTFE濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱為C18柱（島津Shim-pack GISS 1.9 μm×2.1 mm×100 mm）。流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸銨-乙腈（體積比=4∶6）；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫為35 ℃。洗脫方式為等度洗脫。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L/min，霧化器壓力為344.74 kPa；毛細(xì)管電壓為3 500 V。三聚氰胺的定性定量離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺溶液的配制

三聚氰胺是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，微溶于水，可溶于甲醇，但配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)稱(chēng)取的粉末無(wú)法在純水或純甲醇中溶解，故選擇50%甲醇水作為配制儲(chǔ)備液的溶劑。之后工作使用液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用同液質(zhì)上機(jī)條件的流動(dòng)相進(jìn)行逐級(jí)稀釋。

2.2 前處理過(guò)程的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇和優(yōu)化。大豆分離蛋白屬于高蛋白基質(zhì)，因而提取溶劑選擇了具有蛋白沉淀功能的三氯乙酸和乙酸鉛溶液。試驗(yàn)對(duì)比了1% 三氯乙酸、3%三氯乙酸，發(fā)現(xiàn)高濃度三氯乙酸沉淀蛋白的效果更加明顯，但是隨著提取溶劑中三氯乙酸含量的增加，對(duì)色譜分析中色譜峰形產(chǎn)生較大影響或者有不出峰的現(xiàn)象。引入乙酸鉛溶液進(jìn)行共沉淀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)效果沒(méi)有顯著提升，且有引入重金屬的風(fēng)險(xiǎn)，最終選擇1%三氯乙酸溶液作為提取溶劑使用。

2.2.2 凈化條件的選擇。大豆分離蛋白基質(zhì)呈粉狀，在三氯乙酸溶液中形成懸濁液，高速離心后仍有細(xì)小輕質(zhì)懸浮粉末，濾紙過(guò)濾后肉眼不可見(jiàn)，這一步對(duì)于后續(xù)過(guò)柱凈化尤為重要。未經(jīng)過(guò)濾的上清液會(huì)堵住小柱填料篩板，極大地影響過(guò)柱時(shí)間和回收效率。預(yù)活化后的陽(yáng)離子交換柱CX，上樣后，三聚氰胺被吸附在填料上，依次用水和甲醇清洗樣品中水溶性雜質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽及非離子化脂溶性雜質(zhì)。最終使用5%氨水甲醇?jí)A性溶液三聚氰胺洗脫，洗脫效率可達(dá)98%以上。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 液相條件的優(yōu)化。分離三聚氰胺目標(biāo)物，對(duì)比使用了 HILIC、C8、C18色譜柱，由于三聚氰胺屬于強(qiáng)極性化合物，其在反相C8 色譜柱上保留效果較差，通過(guò)調(diào)整優(yōu)化流動(dòng)相的構(gòu)成和比例，最終在常見(jiàn)的C18柱上得到有效保留并分離出峰，避免了親水性HILIC柱對(duì)進(jìn)樣樣品高比例有機(jī)相的要求，節(jié)約了檢測(cè)成本。本試驗(yàn)利用高效液相色譜儀進(jìn)行樣品分離，故選取適合儀器的島津Shim-pack GISS 1.9 μm×2.1 mm×100 mm C18色譜柱，可以實(shí)現(xiàn)快速分離，在2 min之內(nèi)就能完成單個(gè)樣品的檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。在本試驗(yàn)中的流動(dòng)相，考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇、10 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸水）溶液-甲醇和10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸水）-乙腈6種流動(dòng)相組成體系。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（體積比為40∶60）組成等度洗脫能夠得到更好的峰形和響應(yīng)值，因而選擇了其作為流動(dòng)相。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流（TIC）色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化。分析發(fā)現(xiàn)三聚氰胺的結(jié)構(gòu)，在高能碰撞后容易獲得加氫峰，負(fù)離子模式響應(yīng)較差，故在檢測(cè)中，采用正離子模式檢測(cè)。首先選擇全掃描（SCAN）模式找到三聚氰胺的母離子m/z 127.2，然后選擇強(qiáng)度較高的加氫峰m/z 85.2、m/z 68.2作為子離子。通過(guò)調(diào)整干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化器壓力、碎裂電壓和碰撞能量得到較高的靈敏度，確定最佳的質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 線(xiàn)性范圍和檢出限

在10～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性方程為Y=289.588X+1 643.05，r=0.999 8。以信噪比S/N≥3時(shí)計(jì)算方法的檢出限為5 ？滋g/kg，方法靈敏度達(dá)到限量檢測(cè)要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

對(duì)20 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)6次進(jìn)樣，三聚氰胺保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.09%和1.32%，儀器精密度良好。

2.6 方法的回收率和精密度

以大豆分離蛋白作為樣品，在陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收率和精密度測(cè)定，分別添加1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液0.050、0.125、0.250 mL，得到添加水平分別為20、50、100 μg/kg的3組樣品，分別平行測(cè)6次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果得到樣品中三聚氰胺的加標(biāo)平均回收率在86.7%～101.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，見(jiàn)表2。因此，本文所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論與討論

大豆分離蛋白中的三聚氰胺經(jīng)1%三氯乙酸溶液提取，經(jīng)CX固相萃取柱凈化，用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定，通過(guò)外標(biāo)法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，檢出限為5 μg/kg。樣品加標(biāo)回收率為86.7%～101.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%（n=6）。該方法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、高效，能夠滿(mǎn)足大豆分離蛋白中三聚氰胺的定性和定量檢測(cè)要求。

4 參考文獻(xiàn)

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