纈沙坦抑制高糖環(huán)境下足細(xì)胞損傷的機(jī)制探究

朱伶俐+葉迅

[摘要] 目的 通過(guò)觀察纈沙坦對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞EMT過(guò)程中ILK、MMP9、NEPH1 mRNA表達(dá)的影響，探討纈沙坦保護(hù)受高糖損傷足細(xì)胞的可能機(jī)制。 方法 將培養(yǎng)分化成熟的足細(xì)胞隨機(jī)分為5 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)組（對(duì)照組）和25 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)組（高糖組），在25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液中分別加入2×10-7 mol/L （低Val組）、2×10-6 mol/L （中Val組）和2×10-5 mol/L（高Val組）纈沙坦。體外培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用PCR半定量分析技術(shù)檢測(cè)ILK、MMP9、NEPH1的表達(dá)。 結(jié)果 高糖組細(xì)胞NEPH1的表達(dá)較對(duì)照組顯著減少（P<0.01）。而各劑量纈沙坦干預(yù)組NEPH1的表達(dá)與高糖組相比均顯著升高。與對(duì)照組比較，高糖組足細(xì)胞ILK和MMP9的表達(dá)顯著升高，而各劑量纈沙坦干預(yù)組足細(xì)胞ILK和MMP9的表達(dá)對(duì)比高糖組均明顯減少（P<0.01），其中以高Val組的干預(yù)作用最顯著（P<0.01），高Val組ILK和MMP9的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論 纈沙坦可能通過(guò)抑制ILK通路保護(hù)高糖環(huán)境下受損的足細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞] 纈沙坦；足細(xì)胞；高糖；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.2；R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）33-0035-05

[Abstract] Objective To observe the effect of valsartan on ILK， MMP9 and NEPH1 mRNA expression during the EMT process of podocytes under high glucose environment， and to explore the possible mechanism of valsartan in protecting the podocytes from high glucose. Methods The differentiated mature podocytes were randomly divided into 5 mmol/L glucose culture group （control group） and 25 mmol/L glucose culture group （high glucose group）. 2×10-7 mol/L valsartan （low Val group）， 2×10-6 mol/L valsartan （medium Val group） and 2×10-5 mol/L （high Val group） valsartan were added to 25 mmol/L glucose culture medium. After 48 hours of in vitro culture， the cell morphology was observed by inverted microscope， and the expression of ILK， MMP9 and NEPH1 were detected by PCR semi-quantitative analysis. Results The expression of NEPH1 in high glucose group was significantly lower than that in control group（P<0.01）. The expression of NEPH1 in each dose of valsartan intervention group was significantly higher than that in high glucose group. Compared with the control group， the expression of ILK and MMP9 of podocytes in the high glucose group was significantly increased， and the expression of ILK and MMP9 of podocytes in each dose of valsartan intervention group was significantly lower than that in high glucose group（P<0.01）. The intervention effect in high Val group was the most significant（P<0.01）. The expression of ILK and MMP9 in high Val group was not significantly different from that in control group（P>0.05）. Conclusion Valsartan may protect the podocytes from the high glucose environment by inhibiting the ILK pathway.

[Key words] Valsartan； Podocytes； High glucose； Epithelial-mesenchymal transdifferentiation

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要并發(fā)癥之一，屬于微血管病變的一種，以蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)。蛋白尿的形成，其組織學(xué)基礎(chǔ)可歸納為足細(xì)胞足突融合、脫落，致使腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損。足細(xì)胞通過(guò)已分化上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），失去nephrin、P-cadherin和NEPH1-3等上皮細(xì)胞特征性蛋白的表達(dá)，而上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志蛋白如整合素連接激酶（ILK）、成纖維細(xì)胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein l，F(xiàn)SP-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等的表達(dá)，是損傷腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵因素[1]。足細(xì)胞的EMT過(guò)程存在并影響著DN的進(jìn)程[2]。研究[3]證實(shí)，當(dāng)足細(xì)胞的EMT過(guò)程被抑制，足細(xì)胞其正常的上皮細(xì)胞表型能得以恢復(fù)，蛋白尿也隨之減少。如何逆轉(zhuǎn)該過(guò)程，是目前眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。endprint

2016版《糖尿病腎病防治專(zhuān)家共識(shí)》中，推薦ACEI/ARB作為DN控制血壓的藥物應(yīng)用，在肯定其降壓效果的同時(shí)，鑒于臨床文獻(xiàn)的缺乏，對(duì)其降低尿微量白蛋白的作用不置可否。纈沙坦作為ARB類(lèi)代表性的藥物，在DN的治療中應(yīng)用多年，其降低尿微量白蛋白的療效有目共睹。除降壓效果之外，纈沙坦是否能有效減少DN蛋白尿的形成、減慢腎小球?yàn)V過(guò)率的下降， 延緩DN的進(jìn)展，從而保護(hù)腎臟功能，這值得我們進(jìn)一步探討。

本文通過(guò)觀察ILK、MMP9、NEPH1在不同濃度纈沙坦干預(yù)高糖環(huán)境下足細(xì)胞中的表達(dá)變化，探討纈沙坦除降壓之外，治療DN的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源

1.1.1 細(xì)胞與試劑 小鼠的腎小球足細(xì)胞由英國(guó)倫敦大學(xué)國(guó)王學(xué)院Guy' s 醫(yī)院贈(zèng)送，纈沙坦原粉由諾華生物制藥有限公司提供；10%胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，γ-干擾素購(gòu)自美國(guó) PEPRO Tech公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Trizol提取試劑盒來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司。引物合成PRIMER5.0引物軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。

1.1.2 儀器 ABI7900 實(shí)時(shí)定量熒光 PCR 儀器（美國(guó) ABI 公司）；X70光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；PowerPac Basic WB電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品），GEL DOC凝膠成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)操作復(fù)蘇小鼠腎小球足細(xì)胞，加入含有5 mL 10% FCS1640培養(yǎng)液的25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每培養(yǎng)瓶中含有γ-干擾素500 U，培養(yǎng)箱孵育條件為33℃、5%CO2，細(xì)胞增殖后進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳代用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞，傳代至所需細(xì)胞數(shù)后，轉(zhuǎn)移入含有5 mL 10%FCS1640培養(yǎng)液的25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每瓶不加干擾素，培養(yǎng)箱孵育條件變?yōu)?7℃、5%CO2，培養(yǎng)至細(xì)胞形態(tài)呈“樹(shù)枝狀”，即足細(xì)胞分化成熟。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種已分化成熟的足細(xì)胞，通過(guò)RandA 1.0軟件完全隨機(jī)分組法，將足細(xì)胞分為5 組，每組5 瓶，A組（對(duì)照組D-葡萄糖5 mmol/L）、B組（高糖組，D-葡萄糖25 mmol/L）、C組（低Val組，25 mmol/L D-葡萄糖+纈沙坦 2×10-7 mol/L）、D組（中Val組，25 mmol/L D-葡萄糖+纈沙坦 2×10-6 mol/L）和E組（高Val組，25 mmol/L D-葡萄糖+纈沙坦 2×10-5 mol/L）。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育48 h后，在倒置顯微鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)變化，并以RT -PCR 半定量法檢測(cè)各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.2.3 RT-PCR半定量法檢測(cè)相關(guān)蛋白R(shí)NA表達(dá) 先采用 Trizol 試劑和氯仿按照常規(guī)方法抽提腎小球足細(xì)胞總 RNA ，測(cè)定每個(gè) RNA 樣品的濃度（單位為μg/mL）后，在逆轉(zhuǎn)錄酶M -MuLV 催化下合成 cDNA；在PCR儀上按照特定擴(kuò)增條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)。

25 μL反應(yīng)體系配比：dNTP 0.5 μL ，10 ×buffer 2.5 μL，引物正反義鏈各10 pmol， TaqDNA 聚合酶1.5 u，cDNA 1 μL，加DEPH水至終體積25 μL。陰性對(duì)照即不加入cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 引物正反義鏈序列見(jiàn)表 1。

1.2.4 擴(kuò)增反應(yīng)條件 在94℃ 2 min進(jìn)行預(yù)變性后，根據(jù)不同RNA產(chǎn)物采取預(yù)實(shí)驗(yàn)中取定的退火溫度及循環(huán)數(shù)。見(jiàn)表2。

1.2.5 電泳及凝膠半定量分析 制取1.7%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠），將各PCR產(chǎn)物與DNA Marker（購(gòu)自上海生物工程公司）置入凝膠標(biāo)本孔中，在0.5%TBE液中在100 V/cm下電泳 30 min，通過(guò)BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)分析成像，再以Quantity-one進(jìn)行光密度值測(cè)定，將NEPH1、ILK、MMP9的條帶光密度值與內(nèi)參GAPDH的條帶的光密度值進(jìn)行比較，該光密度比值即代表各相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)的相對(duì)值，提示該種蛋白mRNA的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較在方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane檢驗(yàn)。P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)A組足細(xì)胞分布均勻，基本鋪滿(mǎn)視野，細(xì)胞形態(tài)多為“分支狀”，分化良好，細(xì)胞之間以“樹(shù)枝狀”足突相連，高糖刺激48 h后，足細(xì)胞部分凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，足突短少，部分呈橢圓形；C組即低劑量Val干預(yù)后，可見(jiàn)足細(xì)胞數(shù)量尚可，部分凋亡，足細(xì)胞足突較對(duì)照組短少；D組部分細(xì)胞聚集，貼壁一般，足細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)尚可，足突粗短；E組足細(xì)胞數(shù)量與A組相似，未見(jiàn)明顯凋亡，形態(tài)也呈“分支狀”，足突細(xì)長(zhǎng)。

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組（A組）的腎小球足細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好，形態(tài)分化成熟，具有基本的形態(tài)特征，呈“樹(shù)枝狀”；高糖組（B組）足細(xì)胞部分凋亡，且喪失基本的形態(tài)特征，足突短少。而Val干預(yù)后，各組（C組、D組、E組）細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量均有所恢復(fù)，形態(tài)上更接近對(duì)照組（A組）足細(xì)胞的特征形態(tài)，其中高劑量的Val干預(yù)后（E組）的數(shù)量、形態(tài)變化最明顯。

2.2 腎小球足細(xì)胞ILK、MMP9、NEPH1 mRNA 的表達(dá)情況

相較于對(duì)照組，高糖組的ILK和MMP9 mRNA的表達(dá)均顯著升高（P<0.01），而NEPH1 mRNA的表達(dá)顯著下降（P<0.01）。使用不同劑量Val干預(yù)的高糖環(huán)境刺激下的足細(xì)胞（C組、D組、E組），ILK和MMP9 mRNA的表達(dá)均較高糖組相比有不同程度下降，差異具有顯著性（P<0.01），而NEPH1 mRNA的表達(dá)卻顯著升高（P<0.01），其中高Val組干預(yù)作用最顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而高Val組的ILK、MMP9 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3、圖2、3。endprint

3 討論

足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)，而足細(xì)胞EMT則是足細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。因而逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT過(guò)程，是治療糖尿病腎病，減少尿蛋白排泄的重要途徑。目前認(rèn)為，誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT的信號(hào)通路涉及TGF - β 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、Hedgehog 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、ILK 信號(hào)通路、uPAR 信號(hào)通路等[4-9]。各類(lèi)信號(hào)通路交互運(yùn)作，共同維持間質(zhì)細(xì)胞表型。目前關(guān)于足細(xì)胞損傷修復(fù)的研究，基本基于這些理論，探討通過(guò)抑制或刺激相關(guān)信號(hào)通路中的某一種蛋白的表達(dá)，以期逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT，恢復(fù)足細(xì)胞表型特征。

纈沙坦在糖尿病腎病的防治中占有重要地位。2016年美國(guó)ADA制定糖尿病診療標(biāo)準(zhǔn)中，建議糖尿病腎病患者在積極控制血壓、血糖，優(yōu)化飲食結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在尿白蛋白/肌酐比值（≥30 mg/g）及估算腎小球?yàn)V過(guò)率異常的情況下，適當(dāng)采用ACEI/ARB等藥物控制蛋白尿。

馬麗[10]證實(shí)大劑量纈沙坦確實(shí)能夠明顯減少糖尿病腎病患者尿蛋白的排泄量，推測(cè)可能與纈沙坦抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）手套水平、提高胰島素水平、降低血壓有關(guān)。另有學(xué)者[11]通過(guò)與氨氯地平的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)，纈沙坦對(duì)糖尿病腎病確有獨(dú)立于降壓之外的療效，其機(jī)制可能與其在AngⅡ受體水平全面阻斷的效應(yīng)有關(guān)。另有研究表明[12]，纈沙坦能夠通過(guò)調(diào)控 NADPH 氧化酶表達(dá)，來(lái)干預(yù)高糖刺激后氧化應(yīng)激水平，從而使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而保護(hù)足細(xì)胞的功能，并減少蛋白尿的產(chǎn)生。高峰等[13]發(fā)現(xiàn)纈沙坦具有抑制Notch通路，減少足細(xì)胞丟失，降低尿蛋白排泄水平，延緩腎小球硬化的作用。魏靜等[14]證實(shí)，纈沙坦通過(guò)減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的caspasel2凋亡途徑，減少足細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用。弓慧杰[15]提出纈沙坦能有效延緩腎小管上皮細(xì)胞的纖維化進(jìn)程，具體表現(xiàn)在抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、減少高糖誘導(dǎo)的AP-1高表達(dá)、降低Periostin蛋白表達(dá)方面。纈沙坦是否存在延緩足細(xì)胞EMT的作用，及其作用機(jī)制，尚缺少相關(guān)研究。

腎小球足細(xì)胞相關(guān)蛋白1（NEPH1） 作為足細(xì)胞裂孔隔膜上的標(biāo)志性蛋白，是足細(xì)胞濾過(guò)屏障的重要組成部分，維持裂孔隔膜的完整性。足細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，NEPH1的表達(dá)明顯下調(diào)，故而NEPH1的表達(dá)情況，可用于評(píng)價(jià)足細(xì)胞EMT的程度。如何上調(diào)足細(xì)胞NEPH1的表達(dá)，成為保護(hù)足細(xì)胞的研究熱點(diǎn)[16]。

ILK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于細(xì)胞胞質(zhì)中。其可能通過(guò)整合素途徑調(diào)整相關(guān)蛋白的表達(dá)，破壞基底膜的完整性，從而介導(dǎo)足細(xì)胞EMT過(guò)程[17]。ILK也是TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的下游因子。ILK可直接磷酸化多種具有生物學(xué)功能的下游效應(yīng)分子，如磷酸化GSK-3β，失活的GSK-3β可抑制細(xì)胞內(nèi)β-catenin的降解，β-catenin核內(nèi)聚積反過(guò)來(lái)又可以調(diào)節(jié)EMT進(jìn)程中一列基因的表達(dá)[18]。Li Y等[19]提出，ILK表達(dá)的增加，可促進(jìn)足細(xì)胞snail表達(dá)以及足細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。研究證實(shí)，抑制 ILK的表達(dá)后，可明顯減少蛋白尿的產(chǎn)生。所以，靶向ILK信號(hào)可有效干預(yù)蛋白尿腎病[20]。

MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），是腎小球足細(xì)胞發(fā)生EMT后的表面標(biāo)志物之一。Ⅳ型膠原是構(gòu)成腎小球基底膜的網(wǎng)絡(luò)狀框架的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而MMP9的主要作用就是降解Ⅳ型膠原。正常情況下，基底膜Ⅳ型膠原的合成與分解呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)的平衡。而MMP9的表達(dá)上調(diào)，可以造成基底膜Ⅳ型膠原合成和分解的平衡打破，腎小球基底膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，促進(jìn)足細(xì)胞EMT過(guò)程[21]。大量研究表明，ILK與MMP9的表達(dá)關(guān)系密切，ILK可以上調(diào)MMP9的表達(dá)，而后者也能被ILK抑制劑所抑制，提示ILK可能通過(guò)上調(diào)MMP-9的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT過(guò)程[22]。

本研究證實(shí)，高糖環(huán)境（25 mmol/L葡萄糖）的誘導(dǎo)刺激下，足細(xì)胞NEPH1的表達(dá)與正常環(huán)境下相比明顯下降，而足細(xì)胞的ILK、MMP9的表達(dá)則與正常環(huán)境下相比顯著升高。說(shuō)明高糖環(huán)境下，ILK通路過(guò)度激活可誘導(dǎo)足細(xì)胞EMT。纈沙坦干預(yù)后，高糖損傷的足細(xì)胞NEPH1的表達(dá)相較于正常足細(xì)胞有不同程度的升高，ILK、MMP9的表達(dá)相較于正常足細(xì)胞則有不同程度的減少，這點(diǎn)改變?cè)诟邉┝坷i沙坦組尤為明顯，提示Val的干預(yù)作用呈一定的濃度依賴(lài)性。

綜上所述，Val可能通過(guò)抑制ILK通路有效緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。這為其獨(dú)立于降壓作用之外通過(guò)緩解足細(xì)胞EMT的進(jìn)程來(lái)靶向保護(hù)足細(xì)胞，減輕DN早期蛋白尿，提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-17）endprint