鳳仙花的指紋圖譜研究及2種1,4-萘醌成分的含量測(cè)定

王 芳,王寶華,丁 磊,董潔潔,周廣義,孟慶卿,季文琴

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102)

鳳仙花(ImpatiensbalsaminaL.)為鳳仙花科(Balsaminaceae)鳳仙花屬(Impatiens)1年生草本植物。作為觀賞性植物,鳳仙花在國(guó)內(nèi)外均有種植,其花、莖、葉和種子在民間具有悠久的藥用歷史,其中《中國(guó)藥典》2010年版收載其種子急性子作為藥用部位[1-2]。鳳仙花中含有黃酮類、1,4-萘醌類和有機(jī)酸等多種化學(xué)成分[3]。其中,指甲花醌(HNQ)和指甲花甲醚(MeONQ)是其主要的1,4-萘醌類成分[4-5]。研究表明,鳳仙花中的指甲花醌具有抗菌和抗變態(tài)反應(yīng)活性[6],指甲花甲醚具有抗菌、抗胃腺癌、抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]及抗腫瘤[8-10]等活性。在民間,人們用醋、酒泡鳳仙花進(jìn)行染發(fā)或治療灰指甲[11]。研究表明,灰指甲是由皮膚真菌引起的疾病[12],而指甲花醌和指甲花甲醚又是鳳仙花抗真菌的主要活性成分[13]。對(duì)此,本實(shí)驗(yàn)建立鳳仙花的HPLC指紋圖譜用于鳳仙花的質(zhì)量控制,同時(shí)對(duì)10批不同產(chǎn)地鳳仙花中的2種1,4-萘醌類成分進(jìn)行研究,為提高鳳仙花的質(zhì)量評(píng)價(jià)、控制及進(jìn)一步的開發(fā)利用提供參考[14]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀,包括四元泵、DAD檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、LC1200中文工作站(日本島津公司)；BY-G18型微量高速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平(上海荊和分析有限公司)；0.45 μm微孔濾膜(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2試藥 指甲花醌對(duì)照品(批號(hào)50325)、指甲花甲醚對(duì)照品(批號(hào)MKBJ4863V),均購自北京萬佳首化生物科技有限公司；乙腈(批號(hào)164788)、乙酸(批號(hào)127097)均為色譜純,購自賽莫飛世爾科技有限公司；乙醇為分析純(批號(hào)20160906)，北京化工廠；鳳仙花干品10批(自采或購于河南和安徽等地),具體來源見表1,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為鳳仙花科(Balsaminaceae)鳳仙花屬(Impatiens)鳳仙花(ImpatiensbalsaminaL.)的花。

表1鳳仙花樣品來源

Tab.1 The origin of theImpatiensbalsaminaL.samples

樣品編號(hào)產(chǎn)地備注S1河南省南陽市1號(hào)農(nóng)家自種自采S2北京市學(xué)校自種自采S3河南省南陽市2號(hào)農(nóng)家自種自采S4江西省贛州市1號(hào)農(nóng)家自種自采S5江西省贛州市2號(hào)農(nóng)家自種自采S6安徽省藥店S7安徽省亳州市藥店S8河南省上海義草堂藥店S9河南省南陽市3號(hào)農(nóng)家自種自采S10河南省南陽市4號(hào)農(nóng)家自種自采

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-10 mL·L-1乙酸(B)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；梯度洗脫(0～10 min,20%～25%A；10～20 min,25%～35%A；20～30 min,35%～45%A；30 min～40 min,45%～20%A)?；旌蠈?duì)照品和供試品的HPLC圖見圖1。

圖1HPLC圖

1.混合對(duì)照品；B.供試品；1.指甲花醌；2.指甲花甲醚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.sample；1.lawsone；2.2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

2.2混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取指甲花醌及指甲花甲醚對(duì)照品10.0和20.0 mg,置于同一25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取鳳仙花藥材粉末(過40目篩)0.50 g,置于50 mL離心管中,加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇10 mL,超聲提取,提取條件為：超聲功率210 W,提取溫度40 ℃,提取30 min。將提取液以10 000 r·min-1離心20 min,吸取上清液,再次離心20 min,用0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系 精密量取對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.5和5.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得系列質(zhì)量濃度的溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL,測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù),得指甲花醌和指甲花甲醚的回歸方程分別為y=526 228 699.87x+106 418.24(r=0.999 3)和y=48 612 540.85x+305 337.13(r=0.999 6),結(jié)果表明,2種成分質(zhì)量濃度分別在0.004～0.400和0.008～0.800 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批次鳳仙花藥材粉末0.50 g,按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,計(jì)算得指甲花醌和指甲花甲醚的峰面積RSD值分別為1.04%和1.41%。結(jié)果表明,該儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批次鳳仙花藥材粉末6份,每份0.50 g,按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每次進(jìn)樣10 μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算得指甲花醌和指甲花甲醚的峰面積RSD值分別為1.68%和1.03%。結(jié)果表明,該方法重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批次鳳仙花藥材粉末6份,每份0.50 g,按照2.3項(xiàng)下方法制備成供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件每次進(jìn)樣10 μL,分別于0,2,4,6,8,10和12 h依次進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,指甲花醌和指甲花甲醚的峰面積在10 h內(nèi)的RSD值分別為1.75%和0.93%。結(jié)果表明,供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批次鳳仙花藥材粉末6份,每份0.50 g,加入指甲花醌和指甲花甲醚的對(duì)照品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,指甲花醌和指甲花甲醚的平均回收率分別為98.56%和102.75%,RSD值分別為1.92%和1.96%。結(jié)果表明,該方法的回收率良好。見表2。

表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of recovery test (n=6)

2.5鳳仙花HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.5.1鳳仙花指紋圖譜的測(cè)定 取10批不同產(chǎn)地的鳳仙花粉末各0.50 g,精密稱定,按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣分析。將10批鳳仙花指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”,選取時(shí)間窗寬度為0.1 min,以平均值生成對(duì)照譜圖,經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配,得到指紋圖譜及共有模式對(duì)照指紋圖譜,見圖2～3。結(jié)果顯示,共有模式指紋圖譜中標(biāo)定10個(gè)共有峰,構(gòu)成鳳仙花指紋圖譜的特征峰,其中,利用對(duì)照品證明8號(hào)峰為指甲花醌,9號(hào)峰為指甲花甲醚。

圖210批鳳仙花的HPLC指紋圖譜

8.指甲花醌；9.指甲花甲醚。

Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches ofImpatiensbalsaminaL.

8.lawsone；9.2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

圖310批鳳仙花藥材的HPLC指紋圖譜共有峰

8.指甲花醌；9.指甲花甲醚。

Fig.3 10 characteristic common peaks in HPLC fingerprints ofImpatiensbalsaminaL.

8.lawsone；9.2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

2.5.2相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分析 通過保留時(shí)間定性可知,9號(hào)峰為指甲花甲醚的色譜峰,該峰分離度較高、峰形較好、峰面積值所占比例較大且出峰保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定,將其定為參照峰,設(shè)其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1,計(jì)算共有峰對(duì)它的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果見表3～4。由表3～4可知,10批鳳仙花共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值差異較小,而各特征峰相對(duì)峰面積的RSD值相差較大,說明鳳仙花品種成分種類相近,但含量差別較明顯,因此有必要建立相應(yīng)指紋圖譜和特征峰的含量測(cè)定,以提高藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[15]。

表3鳳仙花共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

Tab.3 Relative retention time of common peaks ofImpatiensbalsaminaL.

峰號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10xRSD/%10.1120.1130.1120.1120.1120.1120.1120.1120.1120.1120.1120.4020.1260.1260.1260.1270.1250.1260.1250.1260.1250.1260.1260.4830.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.0440.1530.1530.1530.1530.1540.1530.1530.1530.1530.1530.1530.1950.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.0360.4560.4560.4580.4560.4550.4540.4550.4530.4540.4550.4550.2770.5380.5380.5410.5380.5380.5370.5380.5350.5370.5370.5380.2780.7400.7410.7430.7410.7400.7380.7390.7370.7390.7390.7390.2391.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00101.2501.2511.2531.2521.2511.2481.2491.2471.2491.2501.2500.14

表4鳳仙花共有峰的相對(duì)峰面積

Tab.4 Relative peak area of common peaks ofImpatiensbalsaminaL.

峰號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10xRSD/%10.0890.1040.1470.1200.2170.1520.1280.1520.2190.3190.33620.4820.1480.3340.2660.3500.3430.2490.1860.2500.4230.6910.51829.4630.1070.2090.2230.2580.3160.2380.1620.2460.2970.6290.34340.9240.0290.0580.0590.0880.0760.0530.0400.0560.0830.1690.4598.4750.1320.2530.3010.2260.3940.2790.2020.2370.2280.6390.43332.3960.4850.3330.4380.4660.6150.5020.3790.4700.7241.0230.36555.2870.4210.6360.3331.1820.4100.4090.2200.6510.8211.9190.70072.9680.5541.8000.1650.4080.0550.3040.1160.4540.0962.1510.610121.6191.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00100.3970.4550.4960.4950.9060.4610.4210.4900.7330.5600.54129.28

2.5.3相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”,以S1號(hào)批次(河南省南陽市1號(hào))對(duì)10批樣品的色譜進(jìn)行比較分析,結(jié)果見表5。由表5可知,10批藥材中7個(gè)批次的藥材與對(duì)照指紋圖譜間的相似度大于0.9,3個(gè)批次藥材與對(duì)照指紋圖譜間的相似度在0.837～0.957之間。

表5樣品特征圖譜與共有特征圖譜R的相似度

Tab.5 The results of similarity between specific chromatogram and common specific chromatogramR

樣品編號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對(duì)照指紋圖譜S11.0000.8510.8880.8990.8290.9120.8590.8920.8580.7410.957S20.8511.0000.6610.7560.5880.7310.6330.7720.6330.7750.839S30.8880.6611.0000.8360.9530.9620.9070.9050.8800.7350.939S40.8990.7560.8361.0000.8090.8670.7960.8920.9280.7490.930S50.8290.5880.9530.8091.0000.9390.9000.8780.9000.6940.906S60.9120.7310.9620.8670.9391.0000.9460.9620.8920.7770.972S70.8590.6330.9070.7960.9000.9461.0000.9100.8840.5570.896S80.8920.7720.9050.8920.8780.9620.9101.0000.8880.7980.969S90.8580.6330.8800.9280.9000.8920.8840.8881.0000.6210.907S100.7410.7750.7350.7490.6940.7770.5570.7980.6211.0000.837對(duì)照指紋圖譜0.9570.8390.9390.9300.9060.9720.8960.9690.9070.8371.000

2.6不同產(chǎn)地鳳仙花藥材含量測(cè)定 將購于不同產(chǎn)地的10批鳳仙花藥材除雜,粉碎,過40目篩,分別精密稱定粉末0.50 g,按照2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備,平行3組,得待測(cè)樣品。在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,得到峰面積后,計(jì)算指甲花醌和指甲花甲醚的含量。結(jié)果見表6。

表610批鳳仙花中2種1,4-萘醌類的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.6 The contents of 2 kinds of 1,4-naphthoquinone in 10 batches ofImpatiensbalsaminaL. (mg·g-1,n=3)

樣品編號(hào)指甲花醌指甲花甲醚S10.30375.8813S20.73864.3398S30.05843.9693S40.13813.6419S50.01132.8330S60.11404.0343S70.02464.2249S80.13024.4739S90.02182.8529S100.24711.7849

3 討論

中藥質(zhì)量控制研究是保證中藥安全性和有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié),多指標(biāo)定量測(cè)定已成為中藥質(zhì)量控制較為常用的方法之一[16]。本研究采用HPLC法對(duì)北京市、河南省、安徽省等10個(gè)不同產(chǎn)地鳳仙花的指紋圖譜進(jìn)行研究并對(duì)其含有的2種1,4-萘醌類成分進(jìn)行含量測(cè)定。指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致,差異主要表現(xiàn)為各共有峰相對(duì)峰面積差異顯著,相似度分析結(jié)果顯示相似度跨度較大。同時(shí),以指甲花醌和指甲花甲醚為主要特征成分的含量測(cè)定結(jié)果也顯示，不同地區(qū)鳳仙花中2種1,4-萘醌類成分的含量差異明顯,表明不同產(chǎn)地鳳仙花藥材質(zhì)量有優(yōu)劣之分。由此推測(cè),藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣差異可能與藥材資源的多樣性、藥材采收年限、采收時(shí)間和貯存時(shí)間引起的化學(xué)成分變化和溫度等因素有關(guān)[17-18]。

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