P2X配體門控離子通道7基因多態(tài)性在痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的作用

李曼云，陶金輝，李向培

Fundprogram:National Nature Science Foundation of China(81671601)

痛風(fēng)是一組嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄減少使血尿酸持續(xù)升高而導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶(monoso-dium urate，MSU) 析出并沉積在關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)周圍組織中引起關(guān)節(jié)腫痛的炎性反應(yīng)性疾病，臨床特點(diǎn)為高尿酸血癥及急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作，痛風(fēng)石沉積，慢性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形，常累及腎臟引起慢性間質(zhì)性腎炎和尿酸腎結(jié)石形成。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心測(cè)算，目前我國高尿酸血癥患者超過1.2億，并以每年超過10%的速度迅速增加，已成為嚴(yán)重危害人類身體健康的常見病。因此深入了解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)延緩和控制疾病的發(fā)展具有重要的意義。流行病學(xué)研究表明，只有10%的高尿酸血癥人群會(huì)患痛風(fēng)，表明除了代謝因素外，痛風(fēng)的發(fā)生還有其他因素。現(xiàn)有研究表明：高尿酸血癥可導(dǎo)致MSU晶體的形成，它通過活化的toll樣受體(toll-like receptors，TLR)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3[nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor family, pyrin domain containing 3，NLRP3]炎性小體參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β，導(dǎo)致急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。有研究表明，除體內(nèi)的MSU晶體誘導(dǎo)刺激NLRP3炎性小體生成以外，胞外ATP的變化可以通過刺激嘌呤受體P2X配體門控離子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7, P2X7R)信號(hào)通路，協(xié)同MSU晶體刺激產(chǎn)生NLRP3炎性小體。ATP作為痛風(fēng)發(fā)作的第二信號(hào)，通過P2X7R信號(hào)通路起作用，因此P2X7R的功能狀態(tài)決定了ATP能否誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作[1]。人類 P2X7R 基因上存在許多單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，這些 SNP 位點(diǎn)可以通過影響 P2X7R 膜孔形成能力，從而影響K+外流速度，改變P2X7R 的功能狀態(tài)。本文對(duì)與痛風(fēng)P2X7R基因多態(tài)性相關(guān)聯(lián)的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 P2X7R的結(jié)構(gòu)和功能

P2X7R是P2X家族的重要成員，人類P2X7R位于12號(hào)染色體的長臂上，處于12q24.31的中央位置，由595個(gè)氨基酸(P2X7亞基或單體)組裝成一個(gè)三聚體，形成功能性的P2X7R。P2X7R在多種炎性反應(yīng)性疾病中都起著重要的作用，如多發(fā)性硬化[2]。P2X7R在調(diào)節(jié)核苷酸的促炎作用上發(fā)揮了重要的作用，在急性或慢性炎性反應(yīng)中，它在血管壁細(xì)胞的各種功能中均起著至關(guān)重要的作用。它的獨(dú)特功能主要體現(xiàn)在高濃度ATP的刺激下，P2X7R上可以形成非選擇性陽離子通道或膜孔隙，在巨噬細(xì)胞中足以允許相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為900 000的親水性溶質(zhì)分子通過此孔隙[3]。此外，由P2X7R介導(dǎo)的IL-1β釋放除了在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中起重要作用，還在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、B16黑色素瘤或CT26結(jié)腸癌腫瘤等疾病中具有重要的炎性反應(yīng)性作用[4-6]。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)存在于人體的每個(gè)組織細(xì)胞內(nèi)。而在細(xì)胞表面的嘌呤能受體中有4個(gè)G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體，分為P1嘌呤能受體和P2(P2 receptor，P2Rs)嘌呤能受體。其中，P2受體分為P2X和P2Y，當(dāng)滲透壓發(fā)生變化時(shí)，P2嘌呤能受體可以通過細(xì)胞表面膜通道(主要是泛連接蛋白-1，pannexin-1)將胞內(nèi)ATP釋放到胞外。參與固有免疫反應(yīng)的P2R主要是P2X7R受體，它在參與先天性和適應(yīng)性固有免疫反應(yīng)的所有細(xì)胞中表達(dá)。對(duì)載脂蛋白(apolipoprotein，APO)和ATP結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)的比較表明了通道開啟的機(jī)制：P2X7R與ATP的結(jié)合引起了構(gòu)象上的重組，即P2X7R與ATP的結(jié)合導(dǎo)致了ATP單體的重新組合，形成了所謂的細(xì)胞質(zhì)帽，在結(jié)構(gòu)上，細(xì)胞質(zhì)帽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括兩個(gè)序列，分別為來自N端的β-鏈和來自C終端的β-鏈。細(xì)胞質(zhì)帽的三級(jí)結(jié)構(gòu)由三層β-鏈組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)定義，它位于跨膜域之下，覆蓋了細(xì)胞質(zhì)表面的孔隙，N端的β-鏈和C端的β-鏈相互結(jié)合形成了小的β-膜。在功能上，細(xì)胞質(zhì)帽僅可在與ATP結(jié)合的開放性結(jié)構(gòu)中觀察到，這表明在APO存在的狀態(tài)下，構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)帽的元素是靈活而無序的[7]。從對(duì)人類和老鼠P2X7R的電生理學(xué)分析可得知：大的有機(jī)陽離子的滲透性是P2X7R通道的固有特性，從而不需要漸進(jìn)的孔隙擴(kuò)張達(dá)到陽離子的滲透。然而，P2X7R尾擴(kuò)展的C-末端是保證大孔隙滲透率增加的絕對(duì)要求[8]。螺距的改變使與通道開啟和脫敏相關(guān)的跨膜螺旋體2(transmembrane helix 2，TM2)發(fā)生旋轉(zhuǎn)。細(xì)胞質(zhì)帽的形成固定了TM2的細(xì)胞質(zhì)部分，迫使螺旋延伸成的構(gòu)象從而穩(wěn)定了孔隙的開放。在這過程中，需要P2X7R的C-末端支持TM2的螺旋運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生大的孔隙，以穩(wěn)定由N和C終端之間的相互作用形成的細(xì)胞質(zhì)帽，或者保證允許通過P2X7R通道的最大離子滲透性。當(dāng)通道處于開放狀態(tài)時(shí)，改變N和C終端相互作用的方向，使得Na+和Ca2+快速通過和K+快速流出細(xì)胞膜[7]。

2 與分泌IL-1β有關(guān)P2X7R的SNP

IL-1β在損傷、感染和免疫反應(yīng)中都扮演著重要的角色，同時(shí)也是造成急性和慢性炎性反應(yīng)的重要樞紐。有研究發(fā)現(xiàn)，由脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)刺激P2X7R缺陷型小鼠，小鼠體內(nèi)的IL-1β分泌水平降低， P2X7R缺陷小鼠與野生型小鼠相比，P2X7R缺陷小鼠的血清IL-1β水平更低。提示P2X7R的存在，對(duì)IL-1β的分泌起著重要的作用[9]。由幾個(gè)上游信號(hào)共同激活了NLRP3，包括細(xì)胞內(nèi)K+濃度的改變，細(xì)胞膜上非特異性膜孔隙的形成，溶酶體損傷，線粒體損傷，活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，細(xì)胞體積的變化，以及Ca2+信號(hào)等。而這一過程是由ATP滲透到細(xì)胞膜上，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到900時(shí)，可以損害溶酶體和線粒體，從而增加ROS的量[10]。巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的炎性小體，一旦形成，會(huì)使NLRP3炎性小體復(fù)合物(NLRP3-ACS-NEK7-caspase-1)被激活，前體IL-1β和前體IL-18將會(huì)分別變成IL-1β和IL-18，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌。在產(chǎn)生IL-1β的過程中，細(xì)胞內(nèi)K+濃度的耗竭是激活NLRP3的扳機(jī)點(diǎn)，而對(duì)鉀的抑制則阻止了在對(duì)MSU反應(yīng)中NLRP3依賴的caspase-1的激活，從而對(duì)IL-1β的產(chǎn)生起了關(guān)鍵的作用?，F(xiàn)已知有幾種微生物毒素會(huì)引起炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+的耗竭，因此體內(nèi)陽離子的波動(dòng)可能是一種病原體存在對(duì)免疫細(xì)胞的普遍警醒機(jī)制。另外，在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)，P2X7R的SNPs可能會(huì)影響IL-1β的表達(dá)。有研究表明，P2X7R的SNPs與IL-1β的分泌能力有關(guān)，而不同部位的SNPs對(duì)IL-1β分泌的影響也各不相同。1068 G>A(Ala-348-Thr)的SNP能夠增強(qiáng)P2X7受體分泌IL-1β的能力[11]；489 C>T(His-155-Tyr)的SNP對(duì)編碼P2X7R具有很高的親和力,并且很有可能增強(qiáng)了P2X7R單體的聚合[12]。1513 A>C(Glu-496-Ala)的SNP是P2X7R中的一個(gè)關(guān)鍵部位，它影響了錨蛋白重復(fù)序列模體的胞內(nèi) C-端尾巴，而這個(gè)關(guān)鍵區(qū)域與 P2X7 受體功能是相關(guān)的，從而減少了由P2X7R介導(dǎo)的K+外流的效應(yīng)，進(jìn)而影響由ATP誘導(dǎo)的在單核細(xì)胞中釋放的IL-1β[13]；1096 C>G(Thr-357-Ser)的SNP能夠降低P2X7R分泌IL-1β的能力。

3 原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥患者P2X7R基因多態(tài)性發(fā)生頻率和差異

3.1 與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的常見P2X7R基因多態(tài)性和發(fā)生頻率

在全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)中發(fā)現(xiàn)了SNPs與原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥之間的關(guān)系。許多研究表明，P2X7R的基因多態(tài)性可能會(huì)影響IL-1β的分泌，因此在原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)；痛風(fēng)的P2X7R位點(diǎn)有13個(gè)。除了涉及到的幾種最常見的SNP，包括：rs2230911、rs3751143、rs208294、rs1718119，最新的研究還發(fā)現(xiàn)了與P2X7R基因多態(tài)性和原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥之間的基因聯(lián)系，共9個(gè)位點(diǎn)，分別是：rs435309、rs28360447、s28360457、rs1653624、rs10160951、rs17525809、rs7958316、rs2230912、rs1621388[14-16]。Ying等[16]在對(duì)中國漢族男性人群P2RX7基因多態(tài)性與原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)：rs2230911的基因型在原發(fā)性痛風(fēng)患者和正常人(尿酸值正常設(shè)為正常對(duì)照組)發(fā)生的頻率有顯著的不同，等位基因G的發(fā)生頻率在原發(fā)性痛風(fēng)更高[OR(95%CI)=1.755(1.278，2.410)];而在原發(fā)性痛風(fēng)患者和高尿酸血癥患者之間，沒有顯著的差異[P=0.121;OR(95%CI)=1.438(1.002，2.064)，P=0.048],對(duì)主要模型的分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性痛風(fēng)患者的基因型(CG+GG)發(fā)生頻率高于基因型CC[OR(95%CI)=1.876(1.303，2.701)，P=0.001]。進(jìn)而表明：P2X7R的rs2230911可能與中國漢族男性主要導(dǎo)致痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)因素有關(guān)，而G型等位基因可能是引起原發(fā)性痛風(fēng)的主要易感因素[17]。這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)：rs208294(His 155 Tyr，H155Y或489T→C)影響了受體的胞外域，并通過使155位點(diǎn)的His突變成Tyr，促進(jìn)了P2X7R單體的組裝。Portales-Cervantes等[18]研究發(fā)現(xiàn)：C等位基因的發(fā)生頻率是40.1%，而正常對(duì)照組C等位基因的發(fā)生頻率是45.7%，表明rs435309(rs1752809， Ala，253T→C)突變會(huì)導(dǎo)致P2X7受體功能嚴(yán)重受損。另外，Ying等[16]還發(fā)現(xiàn)：對(duì)rs28360447, rs1718119, rs28360457和rs3751143這4個(gè)基因用哈迪-溫伯格平衡定律(hardy-weinberg equilibrium, HWE)進(jìn)行P值計(jì)算，結(jié)果P值均<0.05，意味著這些值不能滿足連鎖不平衡分析的假設(shè)，表明在這項(xiàng)研究中，計(jì)算這些基因的SNP和原發(fā)性痛風(fēng)之間的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)韓國男性人群的研究顯示，P2X7R的 rs3751142和CARD8的rs2043211多態(tài)性與痛風(fēng)的發(fā)展沒有關(guān)聯(lián)。其中，在痛風(fēng)和正常對(duì)照組之間未發(fā)現(xiàn)rs3751142(C>A)和rs2043211(A>T)的等位基因和基因型的頻率差異，但是通過對(duì)P2X7R的rs3751142和CARD8的rs2043211基因組合在一起進(jìn)行比較得出結(jié)論：與CC/AA組相比，CARD8的rs2043211中TT的隱性純合子和P2X7R的rs3751142中CA的雜合子組合更易患痛風(fēng)[19]。

3.2 與痛風(fēng)有關(guān)聯(lián)的其他基因多態(tài)性

有研究最近發(fā)現(xiàn)了一些與痛風(fēng)有關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)因素，在GWAS僅由臨床定義的日本男性痛風(fēng)病例中，16個(gè)SNPs與痛風(fēng)有關(guān)，并且在已發(fā)現(xiàn)的5個(gè)痛風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)中包括了兩個(gè)新的位點(diǎn)，分別是MYL2-CUX2和CNIH-2[20]。通過對(duì)GWAS和所有痛風(fēng)病例的研究，一項(xiàng)Meta分析篩選了8個(gè)基因位點(diǎn)，為GWAS的關(guān)聯(lián)研究提供了新的證據(jù)，分別是：ABCG2基因rs3114020，SLC2A9基因rs1014290，CUX2基因rs4766566，SLC22A12基因rs2285340，GCKR基因rs1260326， SLC17A1基因rs1165176，HIST1H2BF-HIST1H4E基因rs11758351, CNIH-2基因rs4073582。在這8個(gè)位點(diǎn)中，SLC22A12、SLC17A1和HIST1H2BF- HIST1H4E是全基因組級(jí)別上與GWAS最為接近的首先識(shí)別為痛風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)因素的3個(gè)位點(diǎn)，其中在GWAS上最先識(shí)別了SLC17A1。Hollis-Moffatt等[21]報(bào)道：rs1183201(除了SLC17A1)，其他SNPs在歐洲人和波利尼西亞人的候選基因中均有關(guān)聯(lián)。在這8個(gè)位點(diǎn)中，SLC22A12上的rs2285340位點(diǎn)主要編碼腎臟尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與尿酸鹽的重吸收。HIST1H2BF和HIST1H4E分別表達(dá)H2bf和組蛋白1 H4e，結(jié)合DNA形成核染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。該位點(diǎn)功能的SNPs可能影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，改變細(xì)胞周期、細(xì)胞數(shù)量或?qū)ρ仔苑磻?yīng)的反應(yīng)，從而改變腎和/或腸內(nèi)組蛋白的表達(dá)水平。在GWAS上，針對(duì)痛風(fēng)的亞型，分為腎性尿酸排泄增多性痛風(fēng)(renal overload，ROL)和腎性尿酸排泄減少性痛風(fēng)(renal underexcretion，RUE)。ROL包括4個(gè)位點(diǎn)，分別是：ABCG2基因rs2728104，CUX2基因rs4766566，SLC2A9基因rs3733589，GCKR基因rs1260326。RUE包括7個(gè)位點(diǎn)，分別是：SLC2A9基因rs1014290，ABCG2基因rs1871744，CUX2基因rs4766566，SLC22A12基因rs2285340，GCKR基因rs780094, NIPAL1基因rs11733284，F(xiàn)AM35A基因rs7903456。不同位點(diǎn)在不同的人群中也有差異。值得注意的是，NIPAL1和FAM35A是在GWAS上RUE的最新亞型。NIPAL1作為鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，由9個(gè)膜受體介導(dǎo)，但有最近研究表明其并非尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，可能與尿酸鹽的運(yùn)輸動(dòng)力學(xué)的間接調(diào)節(jié)有關(guān)。最近有研究仍然揭示了高尿酸血癥和鎂的攝入，血清Mg2+水平和Mg2+排泄之間的聯(lián)系[22-24]。GWAS發(fā)現(xiàn)FAM35A與歐洲人、波利尼西亞人、日本人3種人群的痛風(fēng)均有關(guān)聯(lián)，但機(jī)制尚不清楚。

4 結(jié)語

隨著人類生活方式的改變，痛風(fēng)的發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響了當(dāng)今人類的生活質(zhì)量，研究痛風(fēng)和高尿酸血癥有關(guān)的SNPs，可以對(duì)痛風(fēng)易感人群進(jìn)行早期篩查以及早期預(yù)防，并進(jìn)一步針對(duì)這些基因位點(diǎn)，探索新的治療方法，為痛風(fēng)及其關(guān)聯(lián)疾病的研究開啟新的思路。因此，探索新的與痛風(fēng)發(fā)病有關(guān)的SNP并針對(duì)性的應(yīng)用于易感人群，值得進(jìn)一步深入研究。