環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能及其在氣道變應(yīng)性疾病中的作用

田 琴，李 靜，李 勇

氣道變應(yīng)性疾病是特應(yīng)性個(gè)體接觸變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病,其病理過程涉及肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的活化、脫顆粒及釋放炎性介質(zhì),并有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞的共同參與，從而引起血管通透性增加，氣道平滑肌收縮，黏液分泌增多及氣道高反應(yīng)性和重塑。此類疾病以變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)和支氣管哮喘居多，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-2]。目前AR和哮喘的發(fā)病率呈顯著增加的趨勢，不僅影響患者的學(xué)習(xí)、工作、睡眠及生活質(zhì)量，而且給個(gè)人和社會帶來了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，進(jìn)一步探尋氣道變應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制對疾病的防治具有重要的臨床意義。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是新確認(rèn)的一類非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)分子。近年來隨著RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)circRNA大量存在于真核細(xì)胞中，可參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，并且可通過微小RNA(microRNA，miRNA)海綿作用來調(diào)控基因的表達(dá)，從而在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。考慮到miRNA在氣道變應(yīng)性疾病中的意義以及circRNA作為miRNA海綿的作用，認(rèn)為circRNA可能成為該疾病的治療靶點(diǎn)。本文對circRNA來源、生物學(xué)特性、其在氣道變應(yīng)性疾病中的作用及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，以探討circRNA與氣道變應(yīng)性疾病發(fā)病的關(guān)系。

1 CircRNA概述

1.1 CircRNA的來源

CircRNA是一個(gè)閉合環(huán)狀RNA分子，于20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)于RNA病毒中[5-7]。1979年Hsu等[8]在電子顯微鏡下首次證明circRNA存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。1993年由外顯子來源的circRNA在人體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時(shí)認(rèn)為circRNA僅是一類因外顯子轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生錯誤剪接的副產(chǎn)品，因而對它們的研究不夠深入[9]。近年來，高通量RNA測序研究發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)circRNAs存在于人類、鼠的轉(zhuǎn)錄組和哺乳動物大腦中[10-11]。CircRNA由特殊的前體mRNA可變剪接而產(chǎn)生，其剪接形式具有多樣性，其形成方式包括外顯子環(huán)化和內(nèi)含子環(huán)化(intron circularization)兩類。根據(jù)circRNA中包含的序列可將circRNA分為3類，即僅由外顯子組成的外顯子circRNA(exon circRNA，ecircRNA)[12]、內(nèi)含子套索來源的circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)[13]，及包含外顯子和內(nèi)含子序列的EIciRNA[14]。大部分circRNAs來自外顯子，而少量circRNAs則是由內(nèi)含子直接環(huán)化所形成，其中一些ecircRNAs來自于與剪接因子、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的基因，其外顯子環(huán)化依賴于兩端內(nèi)含子中的反向互補(bǔ)序列[15]。Zhang等[13]提出的ciRNA模型揭示circRNA也可來源于內(nèi)含子，敲除circRNA基因可降低其親本基因的表達(dá)。在EIciRNA中，外顯子被環(huán)化，內(nèi)含子在外顯子之間被保留，EIciRNA主要定位于細(xì)胞核中，與U1 snRNP相互作用，促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[15]。

1.2 CircRNA的生物學(xué)特性

目前研究發(fā)現(xiàn)circRNA具有下列特性：即circRNA很豐富，廣泛存在于人類真核細(xì)胞中，在某些情況下環(huán)狀分子的數(shù)量超過與它們相關(guān)的線性mRNA的10倍以上[9-10，12]。RNA環(huán)化是在平行或同源基因中保存的，表明circRNA具有高度保守性[10，12]。CircRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核糖核酸酶R(RNase R)所降解，結(jié)構(gòu)比線性RNA更穩(wěn)定[12，16-17]；circRNA分子富含miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element，MRE)，通過與miRNA相互作用來競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用，從而在細(xì)胞中發(fā)揮miRNA海綿的作用[18]。

2 CircRNA的功能

研究表明，circRNA作為一種新型的miRNA活性調(diào)控分子,可在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮miRNA海綿、調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄和參與蛋白質(zhì)合成等重要作用[18-19]。

2.1 CircRNA作為miRNA海綿的作用

在circRNA功能的研究中，小腦退化相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(antisense to the cerebellar degenera-tion-related protein1 transcript，CDR1as or ciRS-7)作為miR-7海綿的作用的研究備受關(guān)注。人類CDR1as含有74個(gè)miR-7應(yīng)答元件，并與阿格蛋白(argonaute，AGO)、miRNA效應(yīng)蛋白緊密結(jié)合。CDR1as主要位于細(xì)胞質(zhì)中，并在腦組織中與miR-7高度共表達(dá)[18-19]。Hansen等[18]研究報(bào)道，HEK293細(xì)胞中CDR1as可充當(dāng)miR-7海綿，有效地降低miR-7所產(chǎn)生的基因沉默的潛能。將CDR1as注入斑馬魚胚胎可以重現(xiàn)miR-7沉默引起的中腦容量的減少，再次注入miR-7前體后其中腦容量可以部分地恢復(fù)[19]。另一項(xiàng)關(guān)于睪丸特異性基因SRY的circRNA研究顯示，其包含16個(gè)miR-138的MRE，能顯著降低miR-138的基因沉默效力[18]。研究還發(fā)現(xiàn)在circRNA中miRNA結(jié)合點(diǎn)的基因多態(tài)性下降，這也說明circRNA可作為miRNA海綿而發(fā)揮調(diào)控作用[20]。

2.2 CircRNA對親本基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用

Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，敲除ciRNA能降低其親本基因的表達(dá)，如敲除ci-ankrd52能顯著降低ankrd52 mRNA的表達(dá)，隨著ci-ankrd52積累到其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)與磷酸化Pol II部分共區(qū)域化而對Pol II轉(zhuǎn)錄起正性調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，敲除ci-ankrd52能降低前體-ankrd5的轉(zhuǎn)錄效率，從而下調(diào)ankrd52 mRNA的表達(dá)。因此，ciRNA對Pol II轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正性調(diào)控，促進(jìn)了其親本基因的高效轉(zhuǎn)錄。

另有研究發(fā)現(xiàn)，具有代表性的EIciRNA(circEIF3J和circPAIP2)的敲除分別降低了其親本基因EIF3J和PAIP2 mRNA的表達(dá)水平。敲除EIciRNA可以減少Pol Ⅱ、U1A和U1C蛋白與其親本基因啟動子的結(jié)合，阻斷U1 snRNA，減少 EIciRNA與Pol Ⅱ之間的聯(lián)系，阻止 EIciRNA與其親本基因啟動子之間的相互作用，消除EIciRNA敲除對其親本基因mRNA表達(dá)水平的影響，與此同時(shí)可阻斷結(jié)合位點(diǎn)在EIciRNA的U1 snRNA，減少EIciRNA與Pol Ⅱ和U1 snRNA的相互作用，同時(shí)也減少了親本基因的啟動子與U1 snRNP和EIciRNA的相互作用，降低了親本基因的轉(zhuǎn)錄。這些數(shù)據(jù)均證明EIciRNA通過與U1 snRNA的相互作用而與U1 snRNP結(jié)合，產(chǎn)生的EIciRNAs-U1 snRNP復(fù)合體與它們的親本基因的啟動子Pol Ⅱ相互作用，以增強(qiáng)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

2.3 CircRNA的轉(zhuǎn)錄潛能

理論上講,circRNA缺乏像5′帽和3′poly(A)尾巴的結(jié)構(gòu), 不參與蛋白質(zhì)編碼。然而有研究認(rèn)為，circRNA的起源來自蛋白質(zhì)編碼序列，其開放閱讀框以及某些線性mRNA的帽-獨(dú)立翻譯的存在促使研究人員尋找circRNA翻譯的證據(jù)[21-22]。研究人員于1995年即發(fā)現(xiàn)真核生物轉(zhuǎn)譯器可以啟動包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)元素的circRNA的翻譯[23]。當(dāng)一個(gè)內(nèi)部核糖體插入含有分裂的GFP的小基因時(shí)circRNA會產(chǎn)生GFP蛋白，這表明circRNA可以作為mRNA參與蛋白質(zhì)的合成[24]。Abe等[25]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，circRNA能通過滾環(huán)擴(kuò)增機(jī)制在大腸桿菌(E.coli)翻譯系統(tǒng)中得到有效翻譯，而在真核生物翻譯系統(tǒng)中，circRNA可能通過滾環(huán)擴(kuò)增機(jī)制產(chǎn)生豐富的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。然而，建立內(nèi)源性circRNA翻譯的研究尚未報(bào)道。綜上所述，除了作為miRNA分子海綿外，circRNA的其他功能尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，其調(diào)控基因表達(dá)的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步揭示。

3 CircRNA與疾病的關(guān)系

3.1 CircRNA與氣道變應(yīng)性疾病

CircRNA在氣道變應(yīng)性疾病中的直接研究甚少，但miRNA在氣道變應(yīng)性疾病中的作用已得到證實(shí)。近年來的研究表明，多種miRNAs參與氣道變應(yīng)性疾病的發(fā)病過程，如細(xì)胞因子分泌、炎癥細(xì)胞浸潤及氣道高反應(yīng)性等，在其免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)方面起著關(guān)鍵作用。其中miR-21、miR-155是研究較多的與免疫系統(tǒng)相關(guān)的miRNAs。Lee等[26]研究發(fā)現(xiàn)，接受抗miR-21治療的急性支氣管哮喘模型小鼠肺組織中miR-21選擇性下調(diào)，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤減少，Th2細(xì)胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)的生成減少，同時(shí)肺組織中Th2信號通路的轉(zhuǎn)錄因子水平降低。這表明miR-21可以抑制Th2的激活以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，對變應(yīng)性氣道炎癥的發(fā)展具有抑制作用。Namdari等[27]研究顯示，miR-21影響CD4、CD25、Foxp3和T cell的產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的正性調(diào)控者，在體外誘導(dǎo)Treg的生成過程中發(fā)揮重要作用。Johansson等[28]提出，變應(yīng)性氣道炎癥小鼠模型中，miR-155在變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道炎癥模型小鼠中作為2型固有淋巴細(xì)胞中IL-33信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正性調(diào)控因子對炎癥的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮促進(jìn)作用，miR-155缺乏可以預(yù)防慢性變應(yīng)性氣道炎癥。另有一些miRNAs是一些氣道炎癥相關(guān)介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與氣道炎癥反應(yīng)過程。例如miR-125b在嗜酸粒細(xì)胞性CRSwNP中表達(dá)上調(diào)，通過在氣道上皮細(xì)胞中抑制EIF4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)的表達(dá)而增強(qiáng)Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)的表達(dá)，從而導(dǎo)致嗜酸粒細(xì)胞性CRSwNP黏膜中的嗜酸性粒細(xì)胞增多。這表明miRNA參與了鼻黏膜上皮細(xì)胞變態(tài)反應(yīng)性炎癥的調(diào)控[29]。miR-146在人氣道平滑肌中調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，與哮喘的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[30]。Wu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，哮喘患者體內(nèi)miR-126的表達(dá)顯著上調(diào)。在體外隨著IL-13質(zhì)量濃度升高，miR-126在支氣管表皮細(xì)胞中的表達(dá)量增加。miR-126表達(dá)的上調(diào)與變應(yīng)性哮喘的發(fā)生和治療有關(guān)，故可能是治療哮喘的療效指標(biāo)。因此，這些不同表達(dá)的miRNAs有望成為氣道變應(yīng)性疾病的新型診斷生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

CircRNA作為miRNA海綿可能在免疫應(yīng)答和保護(hù)細(xì)胞抵御微生物感染中發(fā)揮關(guān)鍵的微調(diào)作用[32]。ITCH屬于泛素連接酶E3家族，其在免疫方面的作用主要是控制T細(xì)胞分化和自身免疫功能，而circ-ITCH來源于ITCH基因，富含3個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，包括miR-7、miR-17、miR-214。Li等[33]通過熒光素酶基因檢測證實(shí)，circ-ITCH吸附miR-7、miR-17和miR-124，從而使ITCH表達(dá)水平升高，故circ-ITCH可能參與免疫反應(yīng)。此外，為研究circRNA對RAW264.7巨噬細(xì)胞中降鈣素基因相關(guān)肽誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)的作用，Deng等[34]采用實(shí)時(shí)定量PCR分析法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)mmu_circRNA_007893表達(dá)在降鈣素基因相關(guān)肽預(yù)激的巨噬細(xì)胞中顯著增加，沉默mmu_circRNA_007893后，IL-6 mRNA表達(dá)明顯降低，而mmu-miR-485-5p表達(dá)明顯增加。結(jié)果表明，降鈣素基因相關(guān)肽誘導(dǎo)IL-6 mRNA表達(dá)的作用由mmu_circRNA_007893所介導(dǎo)，mmu_circRNA_007893作為內(nèi)源性mmu-miR-485-5p海綿參與在RAW264.7巨噬細(xì)胞中降鈣素基因相關(guān)肽誘導(dǎo)的IL-6 mRNA的表達(dá)過程。另有研究表明，在LPS刺激后誘發(fā)的應(yīng)答中，敲除mcircRasGEF1B能影響成百上千個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，導(dǎo)致大量基因(包括多種免疫相關(guān)基因)的功能失調(diào)，其中涉及DNA復(fù)制、有絲分裂、巨噬細(xì)胞活化、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-κB，IκB/核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)LPS誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答等[35]。

3.2 CircRNA與其他疾病

目前關(guān)于circRNA與癌癥關(guān)系的研究較為成熟。研究表明，CDR1as/miR-7之間的平衡可能影響一些信號通路，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[36]。另有多項(xiàng)研究證實(shí)，circRNA可能作為新的生物標(biāo)志物用于腫瘤疾病的診斷和治療。Yao等[37]研究發(fā)現(xiàn)，與相鄰的非腫瘤組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中circRNA_100876的表達(dá)水平顯著升高，在非小細(xì)胞肺癌中circRNA_100876表達(dá)的上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期之間密切有關(guān)，表明circRNA_100876與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，可能成為預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

除了癌癥之外，關(guān)于circRNA在其他疾病中的作用也有報(bào)道。Ng等[32，35]研究顯示，LPS誘導(dǎo)的circRNA-mcircRasGEF1B可以通過TLR4/NF-κB信號通路正性調(diào)控ICAM-1 mRNAs的表達(dá)，敲除mcircRasGEF1B能降低LPS誘導(dǎo)的ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，從而影響炎癥反應(yīng)過程。Wan等[38]對LPS誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織中circRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)有957個(gè)circRNAs在大鼠肺組織中有差異性表達(dá)。同時(shí)，circRNA可能通過circRNA-miRNA-gene通路調(diào)控mRNA的表達(dá)水平。由此可見，circRNA參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，其與miRNA的相互作用對于相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。

綜上所述，作為miRNA海綿的circRNA可能通過阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用而改變miRNA靶基因的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)控變應(yīng)性疾病免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，從而調(diào)控氣道變應(yīng)性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。另外，作為一種競爭性內(nèi)源性RNA，circRNA可能調(diào)節(jié)選擇性剪接過程，通過它們在與親本基因剪接競爭的作用促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[13-14,39]，從而與氣道變應(yīng)性疾病相關(guān)聯(lián)。雖然目前我們對circRNA的認(rèn)識相當(dāng)有限，但深入開展miRNA在氣道變應(yīng)性疾病中的研究有望揭示circRNA在氣道變應(yīng)性疾病中的免疫調(diào)控作用及其機(jī)制，并可能作為該疾病基因治療的新靶點(diǎn)。

4 展望

CircRNA曾被認(rèn)為是一類因外顯子轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生錯誤剪接而形成的低豐度RNA分子,因而對它們的研究不夠深入。隨著生物信息學(xué)和RNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，circRNA現(xiàn)已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn)，雖然對circRNA的研究才剛剛開始，對其生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制的研究還面臨著許多挑戰(zhàn)，但其在多種疾病中的應(yīng)用前景已初見端倪。CircRNA的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控層面的基于其作為miRNA海綿和調(diào)控基因表達(dá)的功能，circRNA將可能成為新一代的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。關(guān)于circRNA在氣道變應(yīng)性疾病發(fā)病中的作用機(jī)制及其在基因治療方面的作用等目前尚不清楚，通過研究circRNA在氣道變應(yīng)性疾病中的潛在生物學(xué)功能及其作用機(jī)制，探索circRNA與氣道變應(yīng)性疾病的關(guān)系將有助于進(jìn)一步揭示氣道變應(yīng)性疾病發(fā)病的病理機(jī)制，為該疾病的基因靶向治療提供新的思路。