超臨界流體色譜法拆分某一生物堿類手性化合物

鐘浩，強(qiáng)傳厚，齊永長，吳俊，崔海鞠，宋歡

超臨界流體色譜法拆分某一生物堿類手性化合物

鐘浩，強(qiáng)傳厚，齊永長，吳俊，崔海鞠，宋歡

（宣城職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，安徽 宣城 242000）

目的：通過運(yùn)用超臨界流體色譜法（SFC）分離獲得單一旋光的生物堿類手性化合物。方法：運(yùn)用Thar analytical SFC儀器篩選出最佳的分析方法，并通過超臨界流體制備儀器Waters Thar SFC Prep80優(yōu)化方法并在堿性條件下獲得單一旋光化合物，然后通過Thar analytical SFC和Agilent1200 LC-MS對(duì)獲得的單一旋光化合物進(jìn)行光學(xué)純度和化學(xué)純度的檢查。結(jié)果：運(yùn)用SFC可以將該生物堿類手性化合物分離成4種同分異構(gòu)體，并使化學(xué)純度和光學(xué)純度均達(dá)到99%以上。結(jié)論：SFC可以很好地分離此生物堿類手性化合物，效果較好。

超臨界流體色譜法；光學(xué)純度；化學(xué)純度；生物堿；手性

手性藥物（chiral drug）是分子立體結(jié)構(gòu)和它的鏡像彼此不能夠重合的一類藥物，將互為鏡像關(guān)系而又不能重合的一對(duì)藥物結(jié)構(gòu)稱為對(duì)映體（enatiomer）［1］。已知藥物中約有30%～40%是手性藥物［2］。對(duì)映體具有不同的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)，使用消旋體藥物可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的藥動(dòng)學(xué)行為和作用模式［3］。因此，如何進(jìn)行手性藥物的拆分并提供單一的手性藥物，從而控制藥品生產(chǎn)的質(zhì)量，已成為人們關(guān)注的重大課題。

目前手性拆分已從最開始的直接結(jié)晶拆分［4］、酶拆分［5］、薄層色譜法［6］發(fā)展到膜拆分、液液萃取拆分、分子印跡拆分等新型拆分法等。近年來，基于超臨界流體作為流動(dòng)相具有傳質(zhì)速度快，手性選擇高，分離效果好等特點(diǎn)而開發(fā)出來的超臨界流體色譜法（supercritical fluid chromatography，SFC）廣泛應(yīng)用于手性異構(gòu)體的拆分［7-8］。SFC是一種流動(dòng)相溫度、壓力均高于或略低于臨界點(diǎn)的色譜技術(shù)［9］。超臨界流體具有氣體的低黏度和高擴(kuò)散性，又兼有與液體相近的密度和溶解能力。目前，超臨界CO2因其具有效率高，對(duì)環(huán)境良好，廉價(jià)易得，后處理簡單等特點(diǎn)，一般使用它做SFC的流動(dòng)相［10］。

SFC作為超臨界流體技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要分支，在色譜領(lǐng)域獲得了迅速發(fā)展。SFC可以快速高效地進(jìn)行手性拆分，支持單一構(gòu)型的藥物分子的研究。本實(shí)驗(yàn)使用SFC技術(shù)對(duì)一個(gè)含有4個(gè)異構(gòu)體的手性生物堿消旋體進(jìn)行拆分，首先使用分析級(jí)SFC儀器篩選拆分方法，然后使用制備級(jí)SFC儀器進(jìn)行拆分獲得4個(gè)單一構(gòu)型的化合物，并對(duì)這4個(gè)化合物進(jìn)行光學(xué)純度和化學(xué)純度的檢測(cè)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Thar SFC Prep80、Thar analytical SFC（沃特斯科技有限公司）；Agilent1200LC-MS（安捷倫科技公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海博彩儀器設(shè)備有限公司）；BC-W206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司）；DLSB-低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科儀器設(shè)備有限公司）；布氏漏斗（上海安普科學(xué)儀器有限公司）；一次性使用無菌注射器（20 ml，常州金龍醫(yī)用塑料器械有限公司）。

1.2 試劑 手性生物堿化合物1.3 g（某公司提供）；無水乙醇、異丙醇、甲醇（制備純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；二氯甲烷（制備純，上海政創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司）；氨水（分析純，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司出品）；二乙胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 開發(fā)實(shí)驗(yàn) 色譜柱：ChiralPak AD-H（150 mm×4.6 mm，3 μm），ChiralPak AS-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），ChiralCel OJ-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），ChiralCel OD-H（150 mm×4.6 mm，3 μm），ChiralPak AY-H（150 mm ×4.6 mm，5 μm），ChiralCel OZ-H（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A：超臨界 CO2流體，B：甲醇［0.05%二乙胺（DEA）］、乙醇（0.05%DEA）、異丙醇（0.05%DEA）。檢測(cè)波長：220 nm；流速：2.4 ml/min；柱溫：35℃。

由于待分離樣品為生物堿類，為了改善化合物峰形，防止色譜峰拖尾，在醇類流動(dòng)相中添加了DEA。方法開發(fā)時(shí)，先選擇分離效果較好的手性柱，再改變醇類流動(dòng)相的種類進(jìn)行優(yōu)化。方法初試時(shí)，B相流動(dòng)相的比例為5%～40%，采集時(shí)間15 min（5%～40%，0～8 min；40%，8～11 min；5%，11～15 min）。發(fā)現(xiàn)該化合物在色譜柱上保留較強(qiáng)，無法洗脫。故在方法篩選時(shí)，除使用AD-H色譜柱時(shí)，B相比例更改為40%，采集時(shí)間10 min。由于AD-H色譜柱一般對(duì)化合物保留較強(qiáng)，使用AD-H時(shí)，B相比例更改為55%，流速更改為2.0 ml/min，采集時(shí)間10 min。方法開發(fā)所使用的色譜柱和流動(dòng)相，見表1，共篩選18種方法。

2.2 開發(fā)結(jié)果 經(jīng)過方法開發(fā)實(shí)驗(yàn)篩選，最后確定合理的分析方法為：色譜柱：ChiralPak AD-H（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A：超臨界CO2流體，B：乙醇（0.05%DEA），B相比例：55%；檢測(cè)波長：220 nm；流速：2 ml/min；柱溫：35℃。在該方法條件下，待分離樣品的4個(gè)異構(gòu)體（根據(jù)保留時(shí)間的不同，按照由小到大命名為，異構(gòu)體A、異構(gòu)體B、異構(gòu)體C、異構(gòu)體D）可以達(dá)到基線分離，并且異構(gòu)體D與其它3個(gè)異構(gòu)體分離度很好。分離結(jié)果色譜圖見圖1。

表1 色譜分離條件

圖1 待分離化合物分析色譜圖

2.3 制備分離 由于待分離樣品中含有4個(gè)異構(gòu)體，異構(gòu)體A、B、C僅達(dá)到基線分離，只經(jīng)過1次制備分離難以保證4個(gè)異構(gòu)體都有較高的光學(xué)純度。異構(gòu)體D與其它3個(gè)異構(gòu)體分離度較好，制備時(shí)經(jīng)過一次制備分離得到光學(xué)純度較高的異構(gòu)體D。然后改用粒徑較小的色譜柱，降低流動(dòng)相流速和B相比例，改善異構(gòu)體A、B、C的分離度，經(jīng)過二次制備得到光學(xué)純度較高的異構(gòu)體A、B、C。

2.3.1 一次制備 儀器：Thar 80制備型SFC；色譜柱：ChiralPak AD-H（300 mm×30 mm，20 μm）；流動(dòng)相：A：超臨界CO2流體，B：乙醇（0.2%DEA）；B相比例：55%；流速：80 ml/min；柱溫：38℃；樣品溶解：超聲溶解于乙醇，濃度：13 mg/ml，進(jìn)樣量：3.5 ml/針。制備結(jié)束后，將收集的組分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃水浴上旋干，得到異構(gòu)體A、B、C的混合物以及單一的異構(gòu)體D，見圖2、圖3。

圖2 第一次分離單一進(jìn)樣分離色譜圖

圖3 第一次分離連續(xù)進(jìn)樣分離色譜圖

2.3.2 二次制備 儀器：Thar 80制備型SFC；色譜柱：ChiralPak AD-H（300 mm×30 mm，20 μm），流動(dòng)相：A：超臨界CO2流體，B：乙醇（0.2%DEA），B相比例：40%；流速：65 ml/min；柱溫：38℃。樣品溶解：超聲溶解于乙醇，濃度：10 mg/ml，進(jìn)樣量：3 ml/針。制備結(jié)束后，將收集的組分在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃水浴上旋干，即分別得到單一的異構(gòu)體A、B、C。見圖4、圖5。

圖4 第二次分離單一進(jìn)樣分離色譜圖

圖5 第二次分離連續(xù)進(jìn)樣分離色譜圖

2.4 質(zhì)量控制

2.4.1 光學(xué)純度測(cè)定 經(jīng)過2次制備后得到的4個(gè)單一異構(gòu)體的光學(xué)純度的測(cè)定采用2.2中所述色譜條件，測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 4個(gè)單一異構(gòu)體的光學(xué)純度

2.4.2 化學(xué)純度測(cè)定 經(jīng)過2次制備后得到的4個(gè)單一異構(gòu)體的化學(xué)純度的測(cè)定使用Agilent 1200 LC-MS，測(cè)定結(jié)果見圖7。LC-MS條件：色譜柱：Xtimate C18（2.1 mm×30 mm，3μm）；流動(dòng)相：A：水（0.1%三氟乙酸），B：乙腈（0.1%三氟乙酸）；流速：1 ml/min；柱溫：50℃。

圖7 4個(gè)單一異構(gòu)體的化學(xué)純度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行手性分離的化合物是生物堿，堿性化合物在色譜柱上的峰形經(jīng)常出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這是由于色譜柱殘留的硅羥基和帶正電荷的堿性化合物之間的相互作用引起的。實(shí)驗(yàn)中，在流動(dòng)相中添加了DEA以減少堿性化合物的峰拖尾。DEA相當(dāng)于競爭物，占據(jù)硅羥基的位置，用于消除化合物與殘留硅羥基間的相互作用，使色譜柱鈍化，改善化合物峰形。

在建立化合物的手性分離方法時(shí)，一般首先選擇分離效果最好的手性柱，然后再繼續(xù)優(yōu)化分析條件，可以改變改良劑的種類，降低改良劑的比例，降低流動(dòng)相的流速。多數(shù)情況下，降低改良劑的比例和流動(dòng)相的流速可以改善分離度，但會(huì)延長化合物的保留時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)的二次制備中，為了改善異構(gòu)體A、B、C的分離度，降低了乙醇的比例和流動(dòng)相的流速。本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了2次制備分離，改變的是流動(dòng)相的比例和流速，得到了4個(gè)單一構(gòu)型的化合物。在其它分離含有多個(gè)手性中心的化合物的情況中，也可以根據(jù)方法開發(fā)情況結(jié)合使用不同的色譜柱和改良劑進(jìn)行制備分離。

在實(shí)驗(yàn)樣品制備分離過程中溫度對(duì)分離效果會(huì)產(chǎn)生影響，注意控制循環(huán)水浴的溫度，防止由于溫度的變化引起的分離度的變化。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)使用SFC技術(shù)對(duì)一個(gè)含有4個(gè)異構(gòu)體的手性生物堿消旋體進(jìn)行了拆分，對(duì)得到的4個(gè)單一化合物進(jìn)行了光學(xué)純度和化學(xué)純度的檢測(cè)，均獲得了較高的光學(xué)純度和化學(xué)純度?？梢奡FC方法在這一手性生物堿的手性分離過程中有很好的效果，且在分離過程中對(duì)于堿性化合物可以使用固體填料致純的方法能夠獲得更加的分離效果，為以后生物堿類化合物的手性分離提供了實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)。

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Separation of An Alkaloids of Chiral Compound by Using Supercritical Fluid Chromatography

ZHONG Hao，QIANG Chuanhou，QI Yongchang，WU Jun，CUI Haiju，SONG Huan
（Nursing Department，Xuancheng Vocational and Technical College，Xuancheng 242000，China）

Objective：To separate an alkaloids of chiral monomers by using supercritical fluid chromatography（SFC）.Methods：The best analytical method was obtained by Thar analytical SFC，and then Waters Thar SFC Prep80 was used to separate the alkaloid.The chemical purity and optical purity of chiral monomers were analyzed by Thar analytical SFC and Agilent1200 LC-MS.Result：The chiral monomers were separated by SFC and the chemical purity and optical purity were all over 99%.Conculusion：SFC is a wonderful technique to separate the alkaloid with good effect.

supercritical fluid chromatography；chemical purity；optical purity；alkaloid；chiral

R917

A

1008-2344（2017）06-0498-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.06.012

2017-04-10

（文敏編輯）