氧化苦參堿對胃癌細胞株SGC-7901增殖的影響

李 磊 孫衍福 李 帥 王慶才

(1.泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院消化內(nèi)一科，山東 泰安 271000； 2. 泰安市中心醫(yī)院分院，山東 泰安 271000；3.泰山醫(yī)學院附屬萊蕪醫(yī)院，山東 萊蕪 271100)

氧化苦參堿對胃癌細胞株SGC-7901增殖的影響

李 磊1孫衍福2李 帥3王慶才1

(1.泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院消化內(nèi)一科，山東 泰安 271000； 2. 泰安市中心醫(yī)院分院，山東 泰安 271000；3.泰山醫(yī)學院附屬萊蕪醫(yī)院，山東 萊蕪 271100)

目的 觀察氧化苦參堿(OM)對人胃癌SGC-7901細胞中P21表達的影響，研究其抑制細胞增殖的途徑。方法 首先在體外進行胃癌細胞SGC-7901的培養(yǎng)， 采用流式細胞儀觀察不同濃度(2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml )[1]的氧化苦參堿在24 h和36 h不同時間下對SGC-7901胃癌細胞增殖的抑制效果，然后通過Western blot方法觀察SGC-7901胃癌細胞內(nèi)P21基因表達。結(jié)果 與對照組相比，不同濃度(2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml)OM可使細胞阻滯于G0/G1期[24 h:(67.5±0.1)%,(69.5±1.4)%,(71.0±1.0)% vs. (58.6±0.4)%,P<0.0 5; 36 h：(68.5±0.3)%,(71.9±0.9)%,(78.0±0.4)% vs. (58.8±0.1)%,P<0.05)]，上調(diào)細胞周期負調(diào)控因子P21蛋白表達水平(P<0.05)。結(jié)論 OM可能通過阻滯細胞DNA合成，使胃癌細胞處于G0/G1期，并且可以上調(diào)P21的表達，從而發(fā)揮其抗腫瘤增殖作用。

氧化苦參堿；胃癌；P21；細胞周期；流式細胞術(shù)

氧化苦參堿(Oxymatrine,OM)是從中藥苦參中提取的一種具有抗病毒和抗纖維化作用的生物堿，能夠在患者放化療后顯著提升白細胞水平。近來研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿對腫瘤細胞有著較好的殺傷效果，同時能夠抑制腫瘤細胞的侵襲性，因而目前也廣泛應用于臨床輔助抗癌藥物治療之中[2]。本實驗通過研究氧化苦參堿對于胃癌細胞株SGC-7901增殖的影響，了解其抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑

人胃癌細胞株SGC-7901由深圳市白恩維生物科技有限公司提供；氧化苦參堿購自山東華明藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：011230，規(guī)格：2 ml/*200 mg。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與增殖

1.2.1.1細胞培養(yǎng) 將人胃癌細胞株SGC-7901從液氮中取出，放置在37 ℃的恒溫水浴箱中搖動1～2 min解凍，離心5 min后將上清液倒掉，加入含有10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，制成細胞懸液。在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液。瓶底的細胞數(shù)量面積在80%以上時進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)36 h左右時，取處于對數(shù)生長期的細胞進行胰酶消化，采用1000 r/min離心，10 min后收集細胞，并利用新的培養(yǎng)液重懸細胞，對細胞計數(shù)之后按照每孔1×106的個數(shù)分別接種在6孔細胞培養(yǎng)板中，再次將其在同樣的環(huán)境中培養(yǎng)1夜后，讓細胞貼壁備用。

1.2.1.2與氧化苦參堿共孵育 實驗設(shè)對照組(A1、A2)和實驗組(B1、B2、B3、B4、B5、B6)，當細胞貼壁后于實驗組加入氧化苦參堿溶液，使其終濃度分別為2 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、4 mg/ml，補足體積為220 μl，混勻后放入CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h和36 h，收集細胞和上清液。

1.2.2流式細胞術(shù)分析

①利用冷PBS對藥物處理的細胞進行洗滌，收集細胞；②準備結(jié)合緩沖液，并加入雙蒸水進行稀釋；③取PI工作液加入到結(jié)合緩沖液之中，儲備待用；④收集細胞，去除上清液后將細胞的濃度調(diào)整為1×106/L；⑤將PI工作液加入到細胞懸濁液中，在室溫條件下孵育15 min；⑥加入結(jié)合緩沖液并輕輕搖勻，把實驗用的樣本放在冰上面；⑦流式細胞儀進行檢測，分析細胞DNA含量。

1.2.3Western blot試驗

1.2.3.1細胞蛋白提取 收集不同濃度藥物作用的SGC-7901細胞，PBS洗3次之后，將PBS吸收干凈，冰上反應30 min將細胞刮凈，40 ℃ 12000 r/min離心待測蛋白濃度。在培養(yǎng)皿加入200 μl RIPA裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸，期間多次輕搖培養(yǎng)皿，使其裂解完全，冰上吸上清分裝，置于冰箱保存。

1.2.3.2蛋白質(zhì)濃度測定 將離心待測蛋白加入PBS稀釋為濃度5 mg/ml，-20 ℃保存。根據(jù)樣品的數(shù)量來配置適量的BCA工作液，工作液的配置比例為BCA試劑A∶B為50∶1的體積比。分別按照0，1，2，4，8，12，16，20 μl體積的BSA加入到96孔板之中，并用PBS將其分別補足到20 μl。取適當體積的待測樣品放置在96孔板之內(nèi)，同樣用PBS將其補足到20 μl，每個樣品保持3個平行孔，適當調(diào)整樣品濃度使其OD值能夠滿足在標準曲線內(nèi)。每個孔內(nèi)都分別加入BCA工作液，37 ℃放置30 min。利用酶標儀562 nm測定OD值，并利用標準曲線計算各個樣品蛋白濃度值。最后完成變性及電泳。

1.2.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析處理，用均數(shù)±標準差來表示實驗用的數(shù)據(jù)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，同時用Quantity One軟件分析Western blot，若P≤0.05，則說明具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1OM使細胞堆積于G0/G1期

氧化苦參堿處理SGC-7901人胃癌細胞24 h后，細胞在G0/G1期所占的百分比提高，而S期和G2/M期的細胞百分比下降，具體如表1所示。

氧化苦參堿處理24 h后，經(jīng)過統(tǒng)計學方差分析與均數(shù)兩兩比較LSD-t檢驗分析，實驗組與對照組比較，不同濃度的氧化苦參堿對于胃癌SGC-7901細胞的增殖均有明顯的抑制作用。G0/G1期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比統(tǒng)計學分析結(jié)果分別為：t=1.478,P=0.033；t=1.698,P=0.023；t=1.329,P=0.035；S期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為：t=5.41,P=0.025；t=4.67,P=0.032；t=3.25,P=0.02；G2/M期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為：t=1.35,P=0.03；t=1.59,P=0.04；t=2.58,P=0.01，P均<0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。且根據(jù)統(tǒng)計學分析顯示：OM作用24 h后SGC-7901細胞的細胞周期分布2 mg/ml與3 mg/ml比較結(jié)果：t=2.45,P=0.035；t=3.52,P=0.024；t=1.25,P=0.041，OM作用24 h后SGC-7901細胞的細胞周期分布3 mg/ml與4 mg/ml比較結(jié)果t=2.53,P=0.015；t=5.22,P=0.034；t=2.58,P=0.022。其中P值均小于0.05，提示伴隨氧化苦參堿濃度的增加，使胃癌SGC-7901細胞的細胞周期停滯于G0/G1期的效果越明顯。

表1 OM作用24h后SGC-7901細胞的細胞周期分布

氧化苦參堿處理36 h后，經(jīng)過統(tǒng)計學方差分析與均數(shù)兩兩比較LSD-t檢驗分析，實驗組與對照組相比較，不同濃度的氧化苦參堿對于胃癌SGC-7901細胞的增殖均有明顯的抑制作用。G0/G1期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比t檢驗結(jié)果分別為：t=2.63,P=0.024；t=2.33,P=0.014；t=3.12,P=0.012；S期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為：t=1.32，P=0.033；t=5.41，P=0.024；t=3.21,P=0.036；G2/M期：2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組相比分別為t=6.25,P=0.017；t=3.24,P=0.048；t=3.78,P=0.029)，P<0.05,結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。且根據(jù)統(tǒng)計學分析顯示：OM作用36 h后SGC-7901細胞的細胞周期分布2 mg/ml與3 mg/ml比較結(jié)果：t=4.89,P=0.017；t=7.14,P=0.024；t=6.21,P=0.087，OM作用36 h后SGC-7901細胞的細胞周期分布3 mg/ml與4 mg/ml比較結(jié)果t=4.21，P=0.019；t=2.14，P=0.022；t=3.78,P=0.048。其中P值均小于0.05，因此提示：伴隨氧化苦參堿濃度的增加，使胃癌SGC-7901細胞的細胞周期停滯于G0/G1期的效果越明顯。具體數(shù)據(jù)見表2，圖1。

表2 OM作用36h后SGC-7901細胞的細胞周期分布

2.2氧化苦參堿對細胞周期蛋白的影響

通過Western blot法來檢測P21蛋白水平，來進一步驗證OM對蛋白表達的影響。OM能夠使細胞阻滯在G0/G1期,Western blot法檢測周期蛋白結(jié)果顯示，不同濃度的OM作用于胃癌細胞后P21的蛋白含量不同，表明細胞發(fā)生了周期阻滯。此外在36 h時P21蛋白含量增加最為明顯(P<0.05)，見圖2。

對Western blot檢測法來檢測P21蛋白水平進行分析，結(jié)果顯示，24 h時2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組進行方差分析與均數(shù)兩兩比較LSD-t檢驗結(jié)果分別為：t=5.24,P=0.042；t=7.38,P=0.018；t=1.69,P=0.032；36 h時2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿與對照組進行t檢驗結(jié)果分別為：t=5.32，P=0.014；t=3.54,P=0.021；t=2.45,P=0.034；P值均小于0.05，差異具有統(tǒng)計學意義，即不同濃度的氧化苦參堿對于胃癌細胞中P21蛋白的表達具有明顯的影響。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示24 h時2 mg/ml、3 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達情況比較結(jié)果分別為：t=5.73,P=0.006；3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達情況比較結(jié)果分別為：t=4.77,P=0.036；36 h時2 mg/ml、3 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達情況比較結(jié)果分別為：t=5.68,P=0.007；3 mg/ml、4 mg/ml氧化苦參堿作用下P21蛋白表達情況比較結(jié)果分別為：t=6.72,P=0.023；伴隨濃度的增加，胃癌細胞中P21蛋白表達水平越高，且不同濃度作用下24 h和36 h的胃癌細胞中P21蛋白進行t檢驗分析(t=4.27,P=0.008；t=3.68,P=0.026；t=5.78,P=0.047)P<0.05，結(jié)果具統(tǒng)計學意義，故不同時間下，氧化苦參堿對于胃癌細胞P21蛋白的表達水平影響不同，伴隨時間的增加氧化苦參堿作用下的P21蛋白表達水平越高。具體如表3。

表3 氧化苦參堿作用下P21蛋白的表達水平

圖1 氧化苦參堿對SGC-7901細胞作用36 h后DNA合成的抑制作用

圖2 氧化苦參堿對SGC-7901細胞作用36 h后P21蛋白水平

3 討 論

胃癌目前是全世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，我國則同樣是胃癌發(fā)病率及病死率最高的國家之一，分別為42%和35%，遠遠超出世界的平均水平[3]。近年來，胃癌已經(jīng)逐漸呈現(xiàn)出了年輕化的趨勢，目前19～35歲的胃癌年輕患者比例已經(jīng)上升到了3.3%。為了確保人們的健康，減少胃癌死亡率，迫切需要對胃癌發(fā)展的分子機制進行研究，從而尋求抗胃癌藥物的新靶點。通過已有的研究發(fā)現(xiàn)，OM可以有效抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，誘導腫瘤細胞分化、凋亡，同時能夠提升白細胞，增加免疫活性T細胞，綜合提升機體的免疫力[4]。

此次研究利用流式細胞儀來進行細胞周期的檢測，從細胞生長增殖的角度來分析OM對其的抑制作用。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過OM的作用，SCG-7901細胞在G0/G1期的比例增加，S期細胞的比例減少。表明OM對于胃癌細胞的作用主要體現(xiàn)在阻止其G1/S期的生長，抑制其增殖。從分子生物的研究角度來看，細胞的生命周期包含了G0、G1期、S期、G2期和M期，其中，S期是DNA的合成期,G1期是合成前期，G2期是合成后期。從最初的靜止狀態(tài)G0期開始，細胞通過胞質(zhì)分離和增殖進入到G1期，隨后進入到S期進行DNA的復制[5]。細胞染色體復制正確后，則會進入到M期的有絲分裂的準備期G2期，細胞在M期會產(chǎn)生2個穩(wěn)定遺傳的子細胞。當出現(xiàn)細胞周期監(jiān)測點程序的紊亂，就會出現(xiàn)人體疾病的發(fā)生，包括了癌癥的發(fā)生[6]。細胞生命周期中最為關(guān)鍵的就是DNA的合成期和細胞分裂期[7]。細胞周期的停滯，指的是細胞在受到不利因素的影響時主動停止在某個階段，從而消除所受到的不利影響[8]。近年來的研究中，使惡性腫瘤細胞周期停滯成為一種新的治療方式的嘗試，高等真核細胞之中，調(diào)節(jié)細胞周期活動主要依靠于細胞的周期蛋白，細胞周期蛋白和細胞周期分別依賴性激酶CDK和CDI共同作用完成對細胞周期的調(diào)控[9]。因而，周期蛋白的異常表達，就會和腫瘤的臨床分期、預后、治療等有著密切的聯(lián)系[10]。

本次實驗通過流式細胞技術(shù)和Western bolt方法研究氧化苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞P21的影響，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿能夠上調(diào)P21的表達，可以抑制腫瘤細胞的生長，檢測到細胞周期停滯及凋亡。研究結(jié)果顯示隨著氧化苦參堿作用時間和劑量的增加，對SGC-7901的抑制作用效果越明顯。這是由于氧化苦參堿對細胞凋亡起到誘導作用的同時也會使端粒酶活性下調(diào)，且氧化苦參堿濃度越大、作用時間越長，對腫瘤細胞所表現(xiàn)的抑制作用也越明顯[11]。提示氧化苦參堿通過上調(diào)腫瘤細胞P21基因表達從而實現(xiàn)對其生長的影響，這也為腫瘤治療的藥物靶點研究提供了實驗和理論基礎(chǔ)[12]。

氧化苦參堿對腫瘤細胞增殖起抑制作用，是通過阻滯于G0/G1期，上調(diào)P21阻滯DNA合成。腫瘤細胞蛋白表達的降低和OM對細胞P21轉(zhuǎn)錄抑制有一定的關(guān)系，隨著OM藥物劑量的增加，P21表達也會呈現(xiàn)出逐漸上調(diào)的趨勢。對該現(xiàn)象的產(chǎn)生可以理解為氧化苦參堿對SGC-7901細胞P21表達是從對轉(zhuǎn)錄增強開始，進而會在后期出現(xiàn)量的增加及促進。但對于OM對P21的促進是否存在著MAPK通路、ras基因及通路、trans well等方面的影響，則還需要后續(xù)的實驗研究來探明。

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Effects of Oxymatrine on the expression of P21 in human gastric cancer cell line SGC-7901

LI Lei1SUN Yan-fu2LI Shuai3WANGQing-cai1

(1.Dept. of Gastroenterology, Taian City Central Hospital,Taian 271000,China;2.Taian Central Hospital branch Hospital, Taian 271000,China; 3.Laiwu People's Hospital,Laiwu 271100,China)

Objective:To investigate the effects of Oxymatrine (OM) on the expression of P21 in human gastric cancer cell line SGC-7901 and the mechanism of inhibiting the proliferation of human gastric cancer cells. Methods:Gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured in vitro. Flow cytometry was used to observ.e the inhibitory effects of Oxymatrine(2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml) on the proliferation of SGC-7901 gastric cancer cells at different time of 24h and 36h. The expression of P21 gene in gastric cancer cell line SGC-7901 was observed by Western blot methods. Results: Compared with the control group, different concentration (2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml) OM to cell cycle arrest in G1/G0 phase [24 h:(67.5±0.1)%,(69.5±1.4)%,(71.0±1.0)% vs. (58.6±0.4)%,P<0.0 5; 36 h：(68.5±0.3)%,(71.9±0.9)%,(78.0±0.4)% vs. (58.8±0.1)%,P<0.05)], the expression level of up regulation of cell cycle negative regulatory factor P21 (P<0.05). Conclusion: OM may play a novel role in anti-tumor effect by blocking the cell DNA synthesis, and can up regulate the expression of P21 in G1/G0 phase of in gastric cancer cells.

Oxymatrine;gastric cancer;P21;cell cycle;flow cytometry.

李磊(1979—)，男，山東泰安人，副主任醫(yī)師，博士，主要從事消化系統(tǒng)基礎(chǔ)和臨床研究。

R735.2

A

1004-7115(2018)01-0006-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2018.01.002

2017-11-05)