視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200、VEGF表達(dá)

視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)是一種常見的眼底病，常常引起黃斑水腫，而黃斑水腫是CRVO影響患者視力的主要原因[1，2]。因此，了解CRVO合并黃斑水腫發(fā)病機(jī)制非常重要。CRVO患者視網(wǎng)膜由于缺血缺氧，視網(wǎng)膜細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)增加，繼而VEGF破壞血視網(wǎng)膜屏障，引起血管通透性增加。而在此過程當(dāng)中，VEGF的分泌由很多細(xì)胞因子所調(diào)控，同時VEGF分泌增加亦可影響其他細(xì)胞因子分泌。

CD200屬于白細(xì)胞分化抗原，一種與免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白。在體內(nèi)以兩種形式存在：一種跨膜糖蛋白的形式，一種溶解于血漿中存在(sCD200)。它廣泛表達(dá)于髓系細(xì)胞，T以及B淋巴細(xì)胞中[3]。CD200通過與CD200受體結(jié)合調(diào)節(jié)炎癥以及免疫反應(yīng)[3]。它在視網(wǎng)膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及視網(wǎng)膜的小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)sCD200在糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者的玻璃體中表達(dá)明顯上調(diào)，并可能參與了調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5]。那么sCD200在CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者眼球內(nèi)表達(dá)如何？為了解答該問題，本研究旨在了解CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200濃度以及與VEGF的關(guān)系。

資料與方法

一、對象

本研究納入2015年11月至2017年1月在我院連續(xù)就診的33例(33只眼)CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者，同時選取30例(30只眼)無眼部及全身疾病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者作為對照。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，遵循赫爾辛基宣言的原則，所有患者均簽署了知情同意書。

CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者入選與排除標(biāo)準(zhǔn)：入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)眼底彩照以及熒光素眼底造影(FFA)檢查明確的彌漫性或者囊樣黃斑水腫的CRVO患者；(2)病程超過1個月；(3)需要玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物；(4)最佳矯正視力低于0.5；(5)黃斑水腫沒有接受其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)全身存在可能影響房水中細(xì)胞因子含量的系統(tǒng)性疾病(高血壓除外)；(2)孕婦或者哺乳期患者；(3)不能簽署知情同意書者；(4)除了CRVO之外，伴有其它眼局部疾病者；(5)有眼部手術(shù)史者；(6)糖尿病患者。

二、方法

1.一般檢查：所有患者在我院均接受全面的眼科檢查。CRVO患者接受間接檢眼鏡、眼底彩照，F(xiàn)FA以及相干光斷層掃描儀(OCT)(RTVue-XR; Optovue, Inc)檢查確診。其它檢查包括：裂隙燈檢查，驗(yàn)光，最佳矯正視力，眼內(nèi)壓(IOP)測量，眼部B型超聲檢查等。同時所有研究對象均接受全身的基本檢查包括心率、血壓以及詢問患者的疾病病史。

2.黃斑中央凹厚度測量：采用OCT測量黃斑中央凹厚度，OCT檢查在玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物前1～2 d進(jìn)行。采用線性掃描方式，根據(jù)患者瞳孔大小、合作程度和屈光間質(zhì)等情況對眼底后極部行最大范圍掃描，選用掃描圖像最清晰、掃描位置正且掃描質(zhì)量髙的一次來進(jìn)行檢測分析，并利用軟件分析程序來測量觀測眼黃斑中心凹處視網(wǎng)膜的厚度。黃斑中央凹厚度定義為黃斑中央凹處內(nèi)界膜與視網(wǎng)膜色素上皮之間的距離(圖1)。

圖1 CRVO伴有黃斑水腫患者黃斑中央凹厚度

3.手術(shù)方法：玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物。玻璃體腔注射標(biāo)準(zhǔn)操作流程為：所有患者表面麻醉后，聚維碘酮結(jié)膜囊內(nèi)清潔消毒，開瞼器開瞼后用30號注射器針頭，距離角鞏膜緣處3.5～4 mm進(jìn)針顳下方，玻璃體腔內(nèi)注射雷珠單抗0.05 ml/0.5 mg。

4.房水標(biāo)本采集：CRVO患者：玻璃體體腔內(nèi)注射雷珠單抗前，表面麻醉以及結(jié)膜囊內(nèi)清潔消毒后，采用30G注射器針頭前房穿刺緩緩抽出房水約100 μl。取出房水后轉(zhuǎn)移至微量離心管中，避光保存在-80 ℃超低溫冰箱中。白內(nèi)障患者：在行白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)+人工晶狀體植入術(shù)前，表面麻醉以及結(jié)膜囊內(nèi)清潔消毒后，抽取年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水約100 μl作為正常對照。

5.血液標(biāo)本采集：CRVO患者在行玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物以及白內(nèi)障患者手術(shù)前取清晨空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血5 ml，4 ℃下1000 r/min 離心15 min，取上清液至無菌Eppendof管內(nèi)，放入-80 ℃超低溫冰箱中避光保存直至檢測。

6.細(xì)胞因子分析：所有患者的房水以及血清標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析sCD200以及VEGF的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。ELISA 試劑盒購自美國 BD公司。簡言之：取50 μl房水或血清用移液管移入預(yù)包被單克隆抗體的96孔板，混勻后編號，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫育3 h，再用稀釋好的洗滌液洗板5次，甩干。再在各孔中加入酶標(biāo)試劑50 μl，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min，再用稀釋好的洗滌液洗板5次，甩干。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)50 μl，37 ℃恒溫箱內(nèi)避光反應(yīng)15 min后加入終止液50 μl。采用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD值)，即VEGF水平或者sCD200水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、基本臨床資料

最終，本研究共納入符合入選標(biāo)準(zhǔn)的CRVO患者33例(33只眼)，同時納入白內(nèi)障患者房水作為對照30例(30只眼)。其中CRVO組男性15只眼，女性18只眼，對照組男性13只眼，女性17只眼。平均年齡分別為CRVO組(69.66±12.16)歲，對照組(68.40±5.85)歲。

兩組之間的高血壓患者比例相當(dāng)。CRVO組與對照組相比，兩組之間眼壓、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而兩組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者基本臨床資料見表1。

表1 納入研究對象的基本特征

二、房水中sCD200與VEGF濃度

房水中sCD200與VEGF濃度 CRVO患者房水中sCD200濃度為(109.64 ± 33.18)pg/ml，而對照組患者房水中sCD200濃度為(42.55±28.27)pg/ml，CRVO患者房水中sCD200濃度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.596，P<0.001)。CRVO組房水中VEGF濃度為(323.30±245.40)pg/ml，而對照組房水中VEGF濃度為(151.43±68.40)pg/ml，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.705，P< 0.001)(圖2，3)。

圖2 CRVO與年齡相關(guān)性白內(nèi)障房水中sCD200濃度比較

圖3 CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者與年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中VEGF濃度比較

三、血漿中sCD200與VEGF濃度

CRVO血漿中sCD200濃度為(16.89±6.33)pg/ml，而對照組中sCD200濃度為(15.34±376)pg/ml，兩組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.113，P=0.270)。同樣CRVO患者血漿中sCD200濃度為(14.76±7.32)pg/ml與白內(nèi)障患者血漿中(15.40±4.77)pg/ml VEGF濃度亦相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.404，P=0.688)。

四、CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200與VEGF相關(guān)性

對CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200與VEGF做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示房水中兩個因子濃度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(ρ=0.426 ，P=0.014 )(圖4)。

圖4 CRVO伴發(fā)黃斑水腫房水中sCD200與VEGF呈顯著相關(guān)性

五、CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200與黃斑中央凹厚度相關(guān)性

對CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200濃度與視網(wǎng)膜黃斑中央凹厚度做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示房水中sCD200與黃斑中央凹厚度呈顯著正相關(guān)(ρ=0.468 ，P=0.006 )(圖5)。

圖5 CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中sCD200與黃斑中央凹厚度呈顯著正相關(guān)

六、CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中VEGF與黃斑中央凹厚度相關(guān)性

對CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中VEGF濃度與黃斑中央凹厚度做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示房水中VEGF濃度與黃斑中央凹厚度亦呈顯著正相關(guān)(ρ=0.494 ，P=0.003 )(圖6)。

圖6 CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中VEGF與黃斑中央凹厚度呈顯著正相關(guān)

七、患者房水中sCD200、VEGF與血漿中sCD200、VEGF相關(guān)性

表2 患者房水中sCD200、VEGF與血漿中

CRVO伴發(fā)黃斑水腫的患者房水中sCD200與血漿中sCD200含量無顯著相關(guān)性，同樣房水中VEGF與血漿中VEGF含量亦無顯著相關(guān)性。在對照組中，兩個細(xì)胞因子在血漿中的含量與房水中的含量均未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性(表2)。

討 論

CRVO可導(dǎo)致嚴(yán)重的黃斑水腫，從而引起患者視力下降甚至喪失[6]，而黃斑水腫一旦長時間得不到緩解，可造成視網(wǎng)膜組織的不可逆性損傷[2]。它的病理狀態(tài)表現(xiàn)為：當(dāng)靜脈阻塞形成后，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的廣泛出血及缺血缺氧。繼而引起VEGF表達(dá)異常增高。由于VEGF增加引起視網(wǎng)膜血管通透性增加，繼而引起黃斑水腫[7]。

CD200是一種新型的與免疫抑制有關(guān)的蛋白，在自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮了舉足輕重的作用。最近的研究表明，CD200跨膜糖蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元上，與表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的受體相結(jié)合后，產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-4和IL-10可以上調(diào)CD200表達(dá)，進(jìn)而與小膠質(zhì)細(xì)胞上的CD200受體結(jié)合，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而分泌IL-6以及IL-1β的炎癥因子增加[9，10]。一些初步的臨床研究表明CD200可能是一些自身免疫和炎癥性疾病的重要生物標(biāo)志物，并且可能成為治療這些疾病的靶向藥物[11]。比如在大皰性類天皰瘡患者的血漿以及水泡液中，研究發(fā)現(xiàn)sCD200表達(dá)明顯上調(diào)，而且通過抗IgE單克隆抗體治療后，sCD200的表達(dá)明顯降低[11，12]。同樣，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周輔助T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)CD200表達(dá)明顯上調(diào)，而且表達(dá)的量與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[13]。以上均說明，CD200在免疫及炎癥性疾病中發(fā)揮了重要作用。視網(wǎng)膜組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，CD200在視網(wǎng)膜組織中也參與了調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的過程。在葡萄膜炎的動物模型中發(fā)現(xiàn)CD200 發(fā)揮了重要的作用[4]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在敲除了CD200基因的小鼠中，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞雖然形態(tài)仍然保持正常，但是相對于未敲除CD200基因的小鼠，它表達(dá)的炎癥因子明顯下調(diào)[14]。由此在眼部疾病中，CD200主要參與調(diào)控神經(jīng)炎癥的過程。

通過檢測CRVO患者房水細(xì)胞因子的含量，本研究發(fā)現(xiàn)：相對正常對照組，CRVO患者房水中，sCD200與VEGF表達(dá)均明顯增加，而且在CRVO患者房水中，sCD200與VEGF含量呈正相關(guān)的趨勢。事實(shí)上，Xu[5]等也檢測了糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體腔內(nèi)sCD200的濃度并與對照組(非糖尿病患者，非新生血管患者)比較，發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體腔內(nèi)sCD200因子濃度較對照組明顯升高。同樣作為視網(wǎng)膜缺血性疾病，與我們的研究取得相似的結(jié)論。因此我們推測，sCD200也參與了CRVO患者發(fā)生黃斑水腫的病理過程。

我們同時將sCD200以及VEGF的含量分別與CRVO黃斑中央凹厚度做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)黃斑水腫的程度與sCD200以及VEGF的含量有關(guān)，濃度越高，水腫程度越高。VEGF與黃斑水腫的關(guān)系已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，VEGF可增加血管通透性繼而引起黃斑水腫，基于這一點(diǎn)，目前抗VEGF治療已經(jīng)成為治療各種類型的黃斑水腫的重要治療方法。CRVO患者房水中sCD200因子濃度與黃斑水腫程度的關(guān)系，我們第一次闡述，但是具體機(jī)制尚不明確，期待基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)這個問題。

本研究還檢測了兩組患者血漿中sCD200與VEGF的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無論是sCD200還是VEGF血漿中的濃度，CRVO患者與白內(nèi)障患者血漿中的含量均相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們進(jìn)一步對CRVO組與對照組患者房水中因子濃度與血漿中因子濃度做相關(guān)性分析：sCD200與VEGF在房水中的濃度與在血漿中的濃度均無顯著相關(guān)性。更重要的是房水中的sCD200與VEGF的濃度均遠(yuǎn)高于血漿中的濃度。以上研究結(jié)果提示：黃斑水腫的CRVO患者房水中sCD200濃度升高，是由于眼局部分泌增多，由視網(wǎng)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞或者移行入視網(wǎng)膜的淋巴細(xì)胞等分泌后，通過玻璃體腔彌散入前房，而不是血漿中含量增加滲透入眼內(nèi)所致。

本研究檢測并比較了伴有黃斑水腫的CRVO患者以及年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中一些sCD200與VEGF的濃度，本研究設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，具有一定的優(yōu)勢：(1)本研究第一次檢測了sCD200在伴有黃斑水腫CRVO患者房水中的濃度，并且第一次分析了sCD200與黃斑中央凹厚度的關(guān)系。(2)本研究同時還檢測了血漿中sCD200的濃度，證實(shí)sCD200濃度升高是局部因素所致。本研究亦存在一定不足：首先，樣本量偏少，但是所檢測的細(xì)胞因子濃度兩組之間差異非常明顯，CRVO患者房水中檢測到的濃度是對照組的數(shù)倍因而結(jié)果仍然可靠。其次，由于選擇的都是伴有黃斑水腫的CRVO患者，因而存在選擇性偏倚的可能。再次，由于CRVO患者發(fā)病病程不盡相同，病程是影響黃斑水腫的重要因素，而我們分析sCD200以及VEGF與黃斑水腫的相關(guān)性時，未能矯正病程以及其他混雜因素。最后，我們僅僅檢測的是房水中sCD200以及VEGF的含量，它尚且不能代表玻璃體腔中細(xì)胞因子的濃度，更不能代表視網(wǎng)膜組織中的濃度。因而進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)有待證實(shí)本研究命題。

綜上所述，伴有黃斑水腫的CRVO患者房水中sCD200與VEGF表達(dá)明顯上調(diào)，而且sCD200與VEGF含量與黃斑水腫的程度相關(guān)，sCD200與VEGF的含量越高，黃斑水腫程度越明顯。而且sCD200與VEGF之間呈正相關(guān)。由于本研究尚存在一定的局限性，期待大樣本量的、設(shè)計更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯窟M(jìn)一步證實(shí)本結(jié)論。

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