羊乳及其制品中摻入牛乳成分的雙重PCR檢測

宋宏新， 劉建蘭， 徐秦峰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

國際藥典委員會的食品化學(xué)法典(CAC)調(diào)查報告報道，1980年至2010年，由經(jīng)濟利益驅(qū)使的25個最容易摻假的食品成分中，其中乳成分摻假在學(xué)術(shù)領(lǐng)域排名第二，在媒體報道排名第七，可見乳類摻假檢測的重要性[1].羊乳因其獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值而被多數(shù)消費者青睞，由于羊乳的泌乳期受季節(jié)性的波動影響較大，使得產(chǎn)奶量不如牛乳，且價格高于牛乳，故摻假現(xiàn)象時有發(fā)生，以此來獲取利益[2,3].

由于常見乳品成分及形態(tài)的相似性大，有關(guān)乳物種鑒定一直是一個亟待解決的問題.常見的乳物種鑒定的檢測技術(shù)有基于乳中高含量的蛋白質(zhì)的方法，如免疫學(xué)[2]和電泳的檢測技術(shù)，免疫學(xué)靈敏度較高但易發(fā)生假陽性且抗體保存性不足.電泳分為聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE)[4]、毛細管電泳(CE)[5]和雙向電泳[6]，在歐盟電泳是一種廣泛的有效的牛乳檢測手段，但是，基于蛋白質(zhì)的方法不適于復(fù)雜母體來源的食品，因為很容易受熱處理材料的影響而使得靈敏度降低[7].利用乳的一些特性，如外表、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)的感官分析法近年來也悄然興起[8]，但易隨加工變化而揮發(fā)，加工損失較嚴(yán)重；常用的液相(HPLC)[9]、氣相(GC)[10]色譜檢測方法和紅外(IR)[11]、近紅外(NIR)[12]及核磁共振技術(shù)(NMR)[13]等光譜檢測方法，其中液相和氣相費時費力、需要復(fù)雜的樣品前處理，光譜技術(shù)幾乎無需對樣品預(yù)處理且其適合在線過程控制，但光譜需要建立復(fù)雜的模型，掌握和普及程度不足且儀器昂貴.

基于DNA的PCR技術(shù)，因其在高溫高壓下可以穩(wěn)定存在的特點[14]而在食品摻假領(lǐng)域悄然興起，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品摻假的驗證和證明[15].在乳制品中DNA之所以可以作為摻假的檢測目標(biāo)是由于DNA在高溫、高壓和化學(xué)處理的條件下依然穩(wěn)定存在[16].據(jù)報道，反芻動物的乳可以用作DNA的來源，因為它具有大量的體細胞，主要是白細胞，而且還含有來自擠奶母牛的上皮細胞，且在所有獨立細胞間的結(jié)構(gòu)高度保守[17]，含有適用于PCR擴增的基因組DNA[18].

本實驗則基于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，建立了提取牛羊乳及其制品中的DNA檢測方法，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對DNA片段進行擴增，再以瓊脂糖凝膠電泳來對結(jié)果進行檢測，具有快速、省時、靈敏度較高的特點.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

鮮牛乳樣品采自西安市未央?yún)^(qū)草灘奶牛場；鮮羊奶采自陜西省富平縣金牛乳品公司；鮮奶于-20 ℃保存?zhèn)溆?純羊奶粉、純牛奶粉、全脂奶粉、乳清蛋白粉等市售奶類樣品購自西安市不同的超市.

巴氏殺菌乳制作方法采用《NYT 939-2005 巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》.

牛、羊引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，開蓋前經(jīng)4 000×g離心1 min，使DNA沉在底部，按其管上的OD值加相應(yīng)的滅菌超純水，稀釋成100μmol/L，分裝后再取適量稀釋為10μmol/L -20 ℃保存?zhèn)溆?，待PCR擴增備用.

1.1.2 主要儀器與試劑

(1)主要試劑：2×PCR Mix、DNA MarkerⅠ、快速DNA提取檢測試劑盒、磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司.

(2)主要儀器：高速冷凍離心機(HC-2518R，杭州華創(chuàng)科學(xué)器材有限公司)；普通PCR儀(Bio-Rad，伯樂生命醫(yī)學(xué)上海有限公司)；瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司)；電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-980A，上海復(fù)日科技有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取

液態(tài)乳DNA除脂采用黎穎等[19]除脂方法，并在此方法上略有改動，液態(tài)乳固體乳粉則先加水成為復(fù)原乳再依據(jù)上述方法.取10.0 mL上述處理好的乳樣于離心管中(固體乳粉則稱量40.0 mg，溶于10.0 mL蒸餾水中，混勻)，在4 ℃ 5 000×g離心30 min.除去離心管上層的乳脂，再次將乳混勻，10 000×g離心15 min，用小勺和無菌棉除去上層乳脂，如此重復(fù)兩次.再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂，用2 mL的PBS緩沖液溶解沉淀，并使之懸浮，10 000×g離心10 min，如此重復(fù)三次.最后將沉淀溶于500μL PBS緩沖液中懸浮(固體樣品最終溶于200μL PBS緩沖液中，混勻)，備用.

快速DNA提取方法的建立：采用DNA提取檢測試劑盒進行，并按試劑盒說明略作修改進行.取液體樣品50μL(乳粉處理后樣品為200μL)于1.5 mL的離心管中，加入100μL緩沖液B1(乳粉樣品加50μL)，確保緩沖液可完全覆蓋樣品；用研磨杵將樣品混勻搗碎；加入100μL緩沖液B2(乳粉樣品加50μL)，振蕩混勻，12 000×g離心2 min；小心吸取100μL上清液于另一干凈的1.5 mL離心管中作為模板備用.

磁珠法提取DNA方法的建立：用磁珠法基因組DNA提取試劑盒進行，并按試劑盒說明略作修改進行.取樣品400μL樣品，加入20μL Proteinase K溶液；加入300μL裂解液GHL，振蕩混勻；將離心管置于65 ℃，孵育60 min，期間顛倒混勻3回，每回3～5次；消化完成后置室溫放置5 min，再加入350μL異丙醇，振蕩混勻10 s后加入20μL磁珠懸浮液G，振蕩混勻1 min，共靜置9 min，每3 min振蕩混勻1 min.將離心管放于磁力架上靜置30 s，待磁珠完全吸附后，小心移去液體；取下離心管，加入700μL GDA緩沖液與無水乙醇的混合物(1∶4)，振蕩混勻5 min；再置磁力架上靜置30 s，磁珠完全吸附后，小心吸去液體；將離心管從磁力架上取下，加入700μL PWD漂洗液與無水乙醇的混合物(1∶1)，振蕩混勻2 min；重復(fù)上一步驟，室溫晾干后加入100μL洗脫緩沖液TB，振蕩混勻，置于56 ℃孵育10 min后將其靜置于磁力架上，待磁珠完全吸附將DNA溶液轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，并于4 ℃保存.具體操作按試劑盒說明進行.

1.2.2 引物的選取

本課題涉及到的牛羊源性引物，經(jīng)查找資料，以線粒體12S rRNA的保守序列設(shè)計特異性引物，牛乳和羊乳源性成分?jǐn)U增選取已報道的引物分別來自Bottero等[20](2003).引物序列如表1所示.

表1 本實驗中PCR擴增引物序列

1.2.3 PCR擴增

雙重 PCR 體系和反應(yīng)程序如下：PCR 總反應(yīng)體系為 25μL；其中模板 DNA 2μL，2×PCR Mix 12.5μL，牛和羊的上下游引物(10μmol/μL)各0.5μL，ddH2O 8.5μL.PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min， 94 ℃變性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min；-20 ℃保存.

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳

配制2.5%瓊脂糖凝膠，調(diào)整電泳儀電壓50 V，電泳約120 min，經(jīng)EB染色30 min，滅菌雙蒸水脫色10 min，置凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果.本文所有實驗均重復(fù)三次.

2 結(jié)果與討論

2.1 雙重PCR體系的建立

對鮮牛乳及鮮羊乳按照除脂、提取DNA、PCR擴增、電泳等操作方法進行以驗證該方法的靈敏度和選取引物是否合理.其結(jié)果如圖1所示.

M：100 bp Marker；1～2：鮮牛乳；3～4：鮮羊乳；-：雙蒸水空白對照圖1 牛羊乳的雙重PCR電泳方法驗證實驗

從圖1可以清晰地看到，牛羊乳在256 bp和326 bp各自的條帶，且牛乳的條帶亮度要大于羊乳條帶，原因可能是羊乳的蛋白質(zhì)含量高于牛乳，在蛋白質(zhì)消化過程中羊乳蛋白未完全消化，提取出的DNA含量較少，反之，牛乳加的緩沖液的量相對較多，應(yīng)根據(jù)實驗中具體沉淀物的含量來及時的調(diào)整試劑量的多少，以確保實驗更加的準(zhǔn)確.Rogrigues等[21]選取了牛300 bp和羊444 bp的引物擴增片段，條帶暗且不如本研究中圖1清晰.通過靈敏度試驗，可以看出引物特異性良好，該方法具有較好的作為牛羊乳中DNA提取的檢測依據(jù).

2.2 模擬摻假樣品中牛源性成分的檢測

由于乳中DNA主要來自母體(?；蜓?的乳腺細胞里，含量低，且體細胞的數(shù)量又受多方面因素的影響，如，母體動物是否處于哺乳期、乳房健康狀況、個體差異及環(huán)境的影響等[15,22]，故提取乳DNA的質(zhì)量和純度對后續(xù)實驗的開展具有至關(guān)重要的作用.常見成本較低的DNA提取方法有有機溶劑提取法[21]，如利用苯酚-氯仿-異戊醇來逐級對細胞進行破碎來裂解蛋白質(zhì)，最后因DNA與醇的相組成不同(DNA為水相，醇為有機相)而得以分離提取，但該方法使用大量有機溶劑，DNA損失較嚴(yán)重，適用于物質(zhì)中高含量的DNA的提取，故本研究在此基礎(chǔ)上利用快速DNA提取法和磁珠DNA提取法進行方法的對比研究.

在純羊乳中分別摻入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的新鮮牛乳以此作為模擬樣品來檢測其牛源性成分，并以滅菌雙蒸水為空白對照，進而判斷檢測限，并以此作為市售商品摻假的一個基本的檢測依據(jù).并對比兩種DNA提取方法(快速DNA提取法和磁珠DNA提取法)的靈敏度及檢測閾值的差別，實驗結(jié)果如圖2所示.

(a) 快速DNA提取法

(b) 磁珠DNA提取法M：100 bp Marker；1：純鮮牛乳；2～7：摻入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的新鮮牛乳的新鮮羊乳；8:純鮮羊乳；-：空白對照圖2 羊乳中摻入牛乳的雙重PCR檢測

由圖2可得出，快速DNA提取法最低可以檢測到羊乳中10%的牛乳摻假，磁珠 DNA提取法最低可以檢測到羊乳中1%的牛乳摻假.比較可知，使用磁珠DNA提取法檢測閾值更低，電泳條帶整齊而穩(wěn)定，DNA提取質(zhì)量較高，而前者雖操作簡單省時，但蛋白質(zhì)污染較驗證，DNA純度不高，故選用磁珠法進行后續(xù)的實驗較為準(zhǔn)確.

2.3 市售奶制品中牛源性成分的應(yīng)用性檢測

使用磁珠法對含有不同牛乳比例(摻入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的牛乳的巴氏殺菌羊乳)的巴氏殺菌羊乳進行檢測，并以滅菌雙蒸水為空白對照，其結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，條帶雖不如鮮乳的DNA穩(wěn)定規(guī)則，但也可檢測出摻入1%的牛乳成分.

M：100 bp Marker；1：純巴氏殺菌牛乳；2～8：摻入50%、25%、10%、5%、1%和0.5%的牛乳的巴氏殺菌羊乳；-：空白對照圖3 摻入牛乳的巴氏殺菌羊乳的雙重PCR檢測

為進一步驗證方法的適用性，對四個市售不同品牌的羊奶粉樣品，以純牛羊奶粉作對照，應(yīng)用建立的方法進行檢測，其結(jié)果如圖4所示.

圖4顯示，泳道2和5各有兩個條帶，顯示了摻入了牛乳情況，而泳道3僅有牛DNA一個條帶，顯示了幾乎全是牛乳，說明完全摻假，泳道4與泳道1一致，說明未摻假.本課題組在實驗室對多個品牌的液態(tài)羊乳、全脂奶粉、脫脂奶粉及嬰幼兒配方奶粉等16個產(chǎn)品進行了檢測，其中網(wǎng)上選購的8個羊乳摻假產(chǎn)品占半數(shù)以上，而從羊乳產(chǎn)業(yè)大省的陜西本地購買的8個羊乳商品摻假情況則不超過四分之一，故從實際市售樣品檢測結(jié)果來看，為了保護消費者及誠信廠家的權(quán)益，羊乳制品的保真性檢測非常有意義.

3 結(jié)論

本文建立了以牛羊線粒體DNA上的12S rRNA為靶基因而設(shè)計針對牛羊特異性的片段的雙重PCR檢測方法，并以快速法和磁珠法對比，得出使用磁珠法的靈敏度高，DNA純度較高.此前的研究中，磁珠法多用于提取血液中DNA，本文則首次用該法提取具有復(fù)雜的乳成分體系的乳中的DNA，且結(jié)果顯示，在鮮羊乳及巴氏殺菌羊乳中最低能檢測出摻有1%的牛乳的成分，并能直觀檢測出市售羊奶粉的摻假情況，說明經(jīng)過一系列加工的奶粉中DNA依然能夠穩(wěn)定存在，為乳品摻假提供了一個可行的方法.

雙重PCR因其可以同時對兩對引物來擴增兩個目的片段，對食品中摻入一個組分來進行特異性檢測，操作方便直觀，靈敏度高，商業(yè)性摻假從利益與風(fēng)險兩方面考慮，一般以5%為限度，本研究1%檢測閾值已足夠摻假監(jiān)控檢測的要求.但如何應(yīng)對乳品多組分摻假(非乳源性)的引物設(shè)計要求更高，如何化解受電泳樣品數(shù)限制的大規(guī)模普查要求，基于此不足之處，今后應(yīng)在雙重PCR的基礎(chǔ)上，建立多組分食品摻假的多重PCR技術(shù)及考慮大規(guī)模實際應(yīng)用的熒光定量PCR技術(shù)的檢測方法，進一步為乳品摻假的監(jiān)管提供一個方便快捷的技術(shù).

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