雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的生物學(xué)特性鑒定

王啟琛 ， 鄒開宇 ， 王守春 ， 王 平 ， 杜 菲 ， 徐守振 ， 尹燕博

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山東 青島 266109 ； 2.青島澳蘭百特生物工程有限公司 ， 山東 青島 266101)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥以及人類的食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。目前，它被發(fā)現(xiàn)α，β，ε，δ，θ，κ，λ等共計12種毒素，而α、β、ε和t 是主要的致死性毒素，基于魏氏梭菌產(chǎn)生的主要致死毒素與其抗毒素的中和試驗，將菌株分成A，B，C，D和E 5種類型，其毒素均能造成人類或動物感染某些疾病，引起組織損傷[1]。

雞壞死性腸炎(Necrotic enteritis)是由A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞腸道壞死、出血的一種常見病，在全國范圍內(nèi)普遍存在，對中國的養(yǎng)雞業(yè)造成諸多潛在威脅。隨著抗生素使用越來越嚴(yán)格，每年家禽壞死性腸炎的發(fā)病率持續(xù)上升[2]。本研究從山東萊西、安丘、泰安等地送檢的疑似壞死性腸炎的病雞腸道中分離鑒定了3株A型雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌，并對其生物學(xué)特性進行了初步研究，為雞壞死性腸炎的診斷和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 TSB肉湯、血瓊脂、硫酸亞鐵牛乳培養(yǎng)基等，購自青島海博生物科技有限公司；DNA質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；瓊脂糖、PCR反應(yīng)試劑，購自TaKaRa公司；微生物發(fā)酵反應(yīng)管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2.5 L厭氧袋、厭氧罐，購自日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社；PCR儀，購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司；屏障系統(tǒng)動物房和隔離器由青島澳蘭百特生物工程有限公司提供。

1.2 分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察 收集病變腸道，用75%酒精擦拭腸道外壁，接種環(huán)刮取腸道內(nèi)壁，接種在綿羊血瓊脂平板上，在37 ℃的溫箱中厭氧培養(yǎng)24 h。挑取疑似的雙層溶血環(huán)菌落，進行涂片，革蘭染色、鏡檢。對分離的3株菌株分別命名AQ01，KD02，TA03并純化保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生化特性鑒定 分離菌分別接種于葡萄糖、山梨醇、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、明膠、山梨醇、鼠李糖、硝酸鹽等生化反應(yīng)管，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，進行生化鑒定；牛乳發(fā)酵試驗，觀察是否出現(xiàn)牛乳洶涌發(fā)酵現(xiàn)象。

1.4 毒素分型 分離菌分別接種TSB肉湯并厭氧培養(yǎng)24 h，取1.5 mL培養(yǎng)液于離心管中，提取細菌基因組DNA。參考文獻[5]合成5對引物(見表1)：cpa、cpb、etx、iap、cpb2，分別擴增產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β、ε、ι、β2毒素。多重PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 3.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.5 μL，25 mmol/L MgCl24.0 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.5 μL，模板DNA 2 μL；最后用ddH2O補足到30 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、49 ℃～54 ℃ 30 s(第一個循環(huán)退火溫度為54 ℃，然后每隔4個循環(huán)降1度，直至退火溫度降為49 ℃)、72 ℃ 1 min，共進行32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠瓊脂糖進行電泳，觀察結(jié)果。

1.5 α毒素基因與16S rRNA基因分析 分別用擴增cpa(k)和16S rRNA基因的引物克隆α毒素基因和16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物純化后分別連接到T載體，陽性克隆產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。在NCBI下載5種類型產(chǎn)氣莢膜梭菌型代表株的參考序列(登錄號為AY823400.1、D10248.1、D32123.1、D32126.1、D32127.1、D49969.1、D32128.1、X17300.1)，用DNAStar軟件對分離株和參考株序列進行α毒素基因同源性分析；用MegAlign軟件構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，進行遺傳進化分析。

表1 目的基因擴增引物

1.6 藥敏試驗 根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)進行藥敏試驗[3]。挑取單個菌落接種TG培養(yǎng)基，37 ℃厭氧24 h培養(yǎng)。將其用滅菌棉簽均勻涂布于TSC瓊脂平板，稍干后再用無菌鑷子將藥敏紙片貼在普通營養(yǎng)瓊脂平板表面，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后測量各藥物抑菌圈的大小(mm)，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對各種藥物的敏感程度:抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥(R)，10～15 mm為中度敏感(I)，大于15 mm為高度敏感(S)。

1.7 SPF雞致病性試驗 采用活菌計數(shù)法確定3株產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒菌液的活菌濃度為8×109CFU/mL，口腔灌服21日齡SPF雞(每組15只)，0.5 mL/只，對照組灌服相同劑量的無菌生理鹽水，連續(xù)觀察7 d。按照上述方法從病死雞的肝組織和腸道中分離鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果 血瓊脂平板經(jīng)37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后可見灰白色、邊緣整齊、圓形表面光滑菌落，直徑2mm～4 mm，菌落周圍可見溶血環(huán)(見中插彩版圖 1 A)。革蘭染色鏡檢可見陽性粗大桿菌，兩端鈍圓，多單個存在，大小為0.7m～1.3m×1.5m～7m，未見芽胞，符合魏氏梭菌菌落特征(見中插彩版圖 1 B)。

2.2 生化鑒定結(jié)果 3株分離株均發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸，不發(fā)酵山梨醇、甘露醇、鼠李糖，液化明膠，牛乳爆裂。

2.3 毒素分型結(jié)果 多重PCR對分離株毒素分型結(jié)果顯示，3株菌均僅擴增出惟一1條約325 bp大小的α毒素目的條帶(見中插彩版圖 2)，表明三分離株均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.4 α毒素和16s RNA基因分析結(jié)果 對α毒素基因序列分析顯示，分離菌AQ01和KD02、AQ01和TA03、KD02和TA03間α毒素核苷酸同源性分別為98.9%、98.7%、99.3%，氨基酸序列同源性分別為98.7%、98.7%、99.5%；分離株α毒素編碼398個氨基酸，與其他分離株和參考株序列相比， TA03株362位點由Pro突變?yōu)镾er，KD02株162位點由Tyr突變?yōu)镠is、137位點Gln缺失；3分離株與參考菌株α毒素核苷酸序列同源性為97.6%～99.9%，氨基酸同源性為96.5%～99.7%。16S rRNA系統(tǒng)進化分析顯示，AQ01與KD02親緣關(guān)系很近，屬于同一分支，TA03屬于單獨一個分支。

圖3 α毒素氨基酸同源性分析

圖4 16S rRNA基因系統(tǒng)進化分析

2.5 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果顯示，3株分離菌株均對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出耐藥性，均對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐青霉素、哌拉西林藥物表現(xiàn)出高度敏感性，對紅霉素、克林霉素、丁胺卡那霉素等藥物表現(xiàn)出不同程度的敏感。

2.6 SPF雞致病性試驗結(jié)果 3株分離株攻毒21日齡SPF雞7 d后，TA03、AQ01、KD02死亡率分別為100%、60%和10%，毒力強弱依次為TA03、AQ01、KD02。剖檢病死雞可見壞死性腸炎典型病變特征，肝臟變黑變脆、易破裂，有大小不一凹陷(見中插彩版圖5 A)；腸道臌氣，腸壁變薄，腸道黏膜部分出血顯著或壞死(見中插彩版圖5 C)；對照組無任何病變(見中插彩版圖5 B、 D)。從病死雞的肝臟和腸道中又可分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌。

3 討論

近年來，產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，尤其表現(xiàn)在腸壁上大量出血、壞死，容易被誤認(rèn)為流感、球蟲病或新城疫的病變，易延誤病情，造成更大損失。雞壞死性腸炎主要由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，偶見C型，多發(fā)于冬季，雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床病原分離情況逐年增加。本試驗鑒定的3株產(chǎn)氣莢膜梭菌均分離于冬季發(fā)病種雞和肉雞，寒冷季節(jié)為病毒和細菌提供了有利的生存環(huán)境，經(jīng)常會引發(fā)混合感染，導(dǎo)致壞死性腸炎發(fā)生。

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要致死性毒素是α；B型菌主要致死性毒素是α、β、ε；C型菌主要致死性毒素是α、β；D型菌主要致死性毒素是α、ε；E型菌主要致死性毒素是α、t。根據(jù)多重PCR擴增毒素用于魏氏梭菌分型見于很多研究報道[4-7]。本試驗3株雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株經(jīng)多重PCR均鑒定為A型致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，3株分離菌株均對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏霉素B、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出耐藥性，對頭孢類、青霉素類、氧氟沙星等藥物表現(xiàn)出高度敏感性。耐藥性除環(huán)丙沙星不同，其余藥敏試驗結(jié)果與艾地云等[8](2014)A型梭菌藥敏試驗結(jié)果基本相似，與據(jù)張艷等[9](2015)藥敏試驗結(jié)果有差異，這能跟雞場的用藥史有關(guān)，長時間單一用藥可能使細菌出現(xiàn)耐藥性。

產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素是引起動物發(fā)病死亡的重要原因之一，近年來對α毒素的plc基因有很多研究[10]。本試驗分離株間的α毒素氨基酸同源性高，為98.7%～99.5%，但分離株部分位點出現(xiàn)變異和缺失，其中TA03株362位點由Pro突變?yōu)镾er，KD02株162位點由Tyr突變?yōu)镠is、137位點Gln缺失。Nagahama等[11]和Guillouard等[12]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性與α毒素基因的缺失改變有關(guān)。本試驗攻毒結(jié)果顯示，分離株的致病力存在一定差異性，毒力強弱依次為TA03、AQ01、KD02，這些氨基酸的改變是否關(guān)系到菌株毒力的改變，需進一步研究。16S rRNA基因序列是細菌的相對保守的一段序列，其在分析、鑒定細菌進化及親緣性方面具有檢測速度快等優(yōu)勢，是常規(guī)的細菌鑒定和培養(yǎng)方法無法比擬的。16S rRNA系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，AQ01與KD02親緣關(guān)系很近，屬于同一分支，TA03與其他兩株親緣關(guān)系相對較遠。

目前，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎對山東地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞業(yè)造成越來越嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本試驗通過對山東部分地區(qū)雞源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的生物學(xué)特性的鑒定發(fā)現(xiàn)，雞源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性有增強的跡象，且對之前的敏感藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，應(yīng)當(dāng)引起高度重視。

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