葎草乙醇提取物對小鼠十二指腸黏膜免疫相關細胞數(shù)量的影響

周孝瓊 ， 陳洪博 ， 潘燦陽 ， 張 燕 ， 吳蘭芳 ， 王 華

(1.龍巖學院生命科學學院 ， 福建 龍巖 364012 ; 2.福建省家畜疫病防治與生物技術重點實驗室 , 福建 龍巖 364012)

葎草(Humulusscandens)，又名苦瓜藤、鋸鋸藤、拉拉秧、五爪龍、大葉龍五爪蛇干藤，為?？迫劜輰俣嗄晟灾参?。該草喜陰耐寒、耐旱，我國各地均有生長，常生于荒地、廢墟、林緣、溝邊等地。具有清熱解毒，利尿消腫之功效。可用于肺結核潮熱，感冒發(fā)熱，消化系統(tǒng)炎癥及腹瀉，小便不利，腎盂腎炎，急性腎炎，膀胱炎，泌尿系統(tǒng)結石；外用可治癰癤腫毒，濕疹，毒蛇咬傷等[1]。葎草營養(yǎng)價值豐富，含有蛋白質，礦物質、微量元素、維生素、氨基酸等，具有平衡動物營養(yǎng)，加速動物生長和調節(jié)生理機能等作用，且含大量生物活性物質，如多糖、黃酮類化合物、生物堿類，具有天然藥物功能，能增強機體的免疫功能，提高抗病力，增強抗應激能力。葎草乙醇提取物具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化、消除自由基、抗微生物、促進消化、增強免疫等功能[2]。葎草因其生命力強大危害農作物的生長而被稱為惡性雜草，至今未作系統(tǒng)的開發(fā)利用，造成了資源的嚴重浪費。在動物生產中用作飼料原料和飼料添加劑，既可緩解飼料原料緊張的問題，又可利用葎草的藥用價值，減少抗生素的濫用，提高食品安全性，以滿足人們對高品質畜禽產品的需求。本文研究葎草乙醇提取物對小鼠腸道黏膜免疫相關細胞數(shù)量的影響，旨在開發(fā)利用葎草作為新型資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明系健康清潔級小鼠，公母各半，體重18±2.0 g,由福州吳氏實驗動物中心提供。

1.1.2 試驗試劑 葎草，采自田野，切碎、烘干備用；實驗室自配試劑：H.E.染色液，PAS染色液，MTB染色液。

1.1.3 試驗儀器 中藥破碎機(P158)；中藥磨粉機(M150)；超聲波清洗機(KQ-600DV)；旋轉蒸發(fā)儀(N-1100)；真空冷凍干燥機(ALPHA 2-4 LD)；徠卡切片機(LEICA RM 2016)；組織包埋機(LEICA EG 1150H)；麥克奧迪顯微攝影系統(tǒng)(BA310 Digital，CCD:Moticam2506)。

1.2 方法

1.2.1 葎草乙醇提取物的制備 葎草干燥粉碎，過100目篩，準確稱量10 g置于廣口試劑瓶中，分別用20倍、15倍、10倍量70%乙醇浸泡，首次浸泡48 h后，超聲波溫度45 ℃，功率80%，分別超聲50 min、40 min和30 min，每次用布氏漏斗真空泵抽濾，合并3次濾液，旋轉蒸發(fā)儀40 ℃～60 ℃回收乙醇，濃縮、離心，取上清液約10 mL，經真空冷凍干燥機凍干備用。

1.2.2 小鼠動物試驗 將32只健康小鼠隨機分為4組，即對照組、低劑量組(100 mg/kg體重)、中劑量組(200 mg/kg體重)和高劑量組(300 mg/kg體重)，每組8只。小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后開始試驗，試驗組小鼠按體重每天灌胃葎草乙醇提取物生理鹽水溶解液，對照組灌胃生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.3 樣品采集及處理 灌胃30 d后，每組隨機抽取5只小鼠，勁椎脫臼處死，剖檢，分別取每只小鼠十二指腸中段約5 cm，生理鹽水沖洗，浸泡在10%的甲醛固定液中。固定24 h后，取腸中段約1 cm，經水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、常規(guī)石蠟切片后，分別進行 H.E.、PAS染色和MTB染色。

1.2.4 十二指腸黏膜上皮內淋巴細胞(IEL)、杯狀細胞(GC)、肥大細胞(MC)數(shù)量的檢測 H.E.染色和PAS染色的切片，選5根最長、完好、走向平直的絨毛，分別顯微鏡觀察計數(shù)IEL和GC，計數(shù)每 100 個腸黏膜柱狀上皮細胞間的淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量；MTB染色，光鏡下計數(shù)每根腸管橫斷面的腸壁全層(包括黏膜及黏膜下層、肌層及漿膜層)的肥大細胞數(shù)量[3]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件的0ne—WayANOVA法進行方差分析，差異顯著后進行Duncan氏多重比較，以P<0.01(差異極顯著)，P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標準，結果用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 各劑量組對上皮內淋巴細胞數(shù)量的影響 試驗結果見表1和中插彩版圖1。

表1 葎草乙醇提取物不同劑量對小鼠十二指腸黏膜上皮內淋巴細胞數(shù)量的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，含相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下表同

由表1可知，葎草乙醇提取物各劑量組與對照組比較，上皮內淋巴細胞數(shù)量均增加，但低、高劑量組差異不顯著(P>0.05)，中劑量組差異極顯著(P<0.01)。中劑量與低、高劑量組比較差異不顯著(P>0.05)。

中插彩版圖1中箭頭所指細胞為上皮內淋巴細胞(IEL)，經H.E.染色后，小鼠IEL以小型淋巴細胞為主，為染色較深的近似小圓點，多分布于上皮的基底膜附近。

2.2 各劑量組上皮內杯狀細胞數(shù)量的影響 試驗結果見表2和中插彩版圖2。

由表2可知，葎草乙醇提取物各劑量組與對照組比較，低、中劑量組的杯狀細胞數(shù)量差異極顯著(P<0.01)，高劑量組差異不顯著(P>0.05)。中劑量組與高劑量組比較差異極顯著(P<0.01)，與低劑量組比較差異不顯著(P>0.05)。

表2 葎草乙醇提取物不同劑量對小鼠十二指腸黏膜上皮內杯狀細胞數(shù)量的影響

中插彩版圖2中箭頭所指細胞為上皮內杯狀細胞(GC)，一般靠近腸腺部位分布集中，靠近絨毛頂端的杯狀細胞呈散在分布，經PAS染色后杯狀細胞呈紫紅色，高腳杯狀。

2.3 各劑量組對腸黏膜肥大細胞數(shù)量的影響 試驗結果見表3和中插彩版圖3。

表3 葎草乙醇提取物不同劑量對小鼠十二指腸黏膜肥大細胞數(shù)量的影響

由表3可知，葎草乙醇提取物各劑量組與對照組比較，十二指腸黏膜肥大細胞數(shù)量均增加，但低、高劑量組差異不顯著(P>0.05)，中劑量組差異極顯著(P<0.01)。中劑量組與低、高劑量組比較差異不顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 葎草乙醇提取物對小鼠十二指腸黏膜上皮內淋巴細胞數(shù)量的影響 腸上皮內淋巴細胞(IEL)主要位于上皮內基底膜之上的一種特殊的淋巴細胞群體，是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先與外來抗原和病原微生物接觸的免疫活性細胞。具有抑制黏膜超敏反應、中和外源細胞毒作用及分泌淋巴因子等多種功能。在腸黏膜的抗感染免疫、保持腸上皮細胞的完整性及調節(jié)對外來抗原的免疫應答方面均有重要作用[4]。其數(shù)量多少與腸道吞噬抗原能力和殺滅病原微生物效果有關[5-8 ]。因此IEL的數(shù)量可以反映小腸局部黏膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完善程度。本試驗結果顯示，葎草乙醇提取物組十二指腸絨毛上皮內淋巴細胞均高于對照組，低劑量組提高12.66%，中劑量組提高53.07%，高劑量組提高26.21%，尤以中劑量組最為顯著(P<0.01)，結果表明葎草乙醇提取物中劑量能增加小鼠十二指腸黏膜上皮內淋巴細胞數(shù)量，增強免疫能力。這與石玉祥[9]、唐秀瑩[10]等人的研究結果較為一致。

3.2 葎草乙醇提取物對小鼠十二指腸黏膜上皮內杯狀細胞數(shù)量的影響 杯狀細胞(GC)是混在黏膜上皮中的黏液分泌型細胞，底部狹窄，頂部膨大，充滿黏原顆粒，H.E染色為藍色或空泡狀，多為空泡狀。PAS染色使杯狀細胞呈現(xiàn)突出而鮮明的紅色易于觀察。腸道杯狀細胞主要分泌黏蛋白(MUC)、腸三葉因子(ITF)和抵抗素樣分子β(RELMβ)等成分，這些分泌黏液構成腸道表面覆蓋的一層保護性黏液屏障，是腸道固有免疫第一防線的重要組成部分。楊秀娟研究發(fā)現(xiàn)，中藥復方制劑，能顯著提高斷奶仔豬小腸黏膜上皮間的杯狀細胞數(shù)量[11]，閆金坤研究發(fā)現(xiàn)給應激小鼠灌服中藥提取物可以提高小腸黏膜GC數(shù)量[12]。本試驗結果表明，低、中劑量葎草組十二指腸絨毛杯狀細胞數(shù)量顯著高于對照組和高劑量組，低劑量組提高46.02%，中劑量組提高51.86%，其中中劑量組差異最為顯著，說明葎草乙醇提取物能誘導小鼠十二指腸絨毛杯狀細胞數(shù)量及分泌黏液增多，在腸道黏膜構成很好的黏膜機械屏障，對機體腸黏膜起到較好的保護作用。

3.3 葎草乙醇提取物對小鼠十二指腸黏膜肥大細胞數(shù)量的影響 肥大細胞(MC)是胃腸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成成分之一，是一種天然免疫效應細胞，受到刺激活化后分泌多種介質參與黏膜免疫調節(jié)過程，以增強機體對病原菌的清除能力。有研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞經口注入黃芪多糖可使十二指腸MC數(shù)量增多[13]；給小鼠飼喂大蒜溶液可增加腸道中MC數(shù)量[14]。本試驗結果表明，給小鼠灌胃葎草乙醇提取物可增加十二指腸黏膜中的MC數(shù)量，低劑量提高7.10%，中劑量提高33.73%，高劑量提高18.34%，中劑量(200 mg/kg體重)的效果優(yōu)于低、高劑量,使肥大細胞能更迅速的發(fā)揮其免疫調節(jié)作用，提高機體的免疫力。

4 結論

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道上皮細胞相互作用、相互影響， 保護腸道免受細菌、病毒等微生物的粘附和入侵及防止異物的吸收，起到機體第一道防線的作用。而腸道屏障作用主要由IEL、GC和MC等免疫細胞和細胞因子來完成[15-16]。本試驗研究結果為葎草乙醇提取物能夠提高小鼠十二指腸黏膜上皮內淋巴細胞、杯狀細胞和肥大細胞的數(shù)量，進一步增強腸道的黏膜免疫，保護了腸道的完整性與穩(wěn)定性，增強機體抵抗力，提高免疫力，為葎草的開發(fā)利用提供了科學的理論基礎。

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