馬骨關節(jié)炎模型關節(jié)液中CTX-II含量變化的研究

馬天文 ， 王冠穎 ， 李 玥 ， 李欣然 ， 姜仁禮 ， 宋霄鵬 ，張志恒 ， 白 薈 ， 李 新 ， 陳宇航 , 高 利

(1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院 黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗窒 ， 黑龍江 哈爾濱 150030；2.通遼市魯北鎮(zhèn)獸醫(yī)站， 內蒙古 通遼 029100)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種慢性、漸進性、退行性膝關節(jié)疾病，是世界上導致殘疾的主要疾病之一，主要涉及軟骨、關節(jié)滑膜及軟骨下骨，以關節(jié)周圍疼痛及關節(jié)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)[1]。促進馬OA發(fā)病的因素很多，其中正常的關節(jié)受到異常力的作用和異常的關節(jié)受到正常力的作用是主要影響的因素。目前OA 診斷主要依據(jù)臨床癥狀和影像學方法，但早期OA患畜的確診情況并不理想。隨著分子生物學的發(fā)展，近年來國內外學者也致力于發(fā)現(xiàn)一些能夠早期診斷并區(qū)分OA嚴重程度的相關生物學標記物(biomarker, BM)，通過對BM的研究與臨床應用，希望可以在影像學改變出現(xiàn)前，對OA進行早期診斷，并且預測組織結構破壞發(fā)生的可能性及疾病進展，同時評估治療效果[2]。

II型膠原羧基端端肽(C-telopeptide-of-CⅡ, CTX-II)是基質金屬蛋白酶(MMPs)降解II型膠原的產物，為Ⅱ型膠原1/4片段的羧基端端肽，相對分子質量較小，對關節(jié)軟骨破壞危險性的評估具有特異性[3]。CTX-II作為惟一可同時在血液、尿液和滑液中檢測的標志物，其樣品穩(wěn)定性高，對常規(guī)臨床檢測更有意義，因此逐漸成為BM研究的熱點[4]。本研究采用酶聯(lián)免疫夾心法(Sandwich-ELISA)測定馬骨關節(jié)模型關節(jié)液中不同時間點的CTX-II水平，探索CTX-II濃度與OA 發(fā)病程度的關系，為以后建立馬OA的快速診斷技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用13匹蒙古馬，年齡5～8歲，體重331～511 kg，購自黑龍江省肇東市某養(yǎng)殖場。在進入研究之前，所有馬進行臨床檢查，腕關節(jié)攝影，跛行檢查，對腕關節(jié)屈曲反應和滑膜積液的評估，以確保所有測量的變量都在正常參考范圍內。并且每匹馬分別進行體況評分[6]，得分均在4～6分之間。為了適應環(huán)境，在試驗前兩周，將馬拴養(yǎng)在固定的馬圈中，隨意采食飼料，每日放馬1次。

1.2 試劑 鹽酸美沙酮、鹽酸地托咪定、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購自Sigma公司；馬CTX-II成品ELISA試劑盒，購自Shsaimo公司；兩性霉素，購自Amresco公司。

1.3 誘導OA模型 將13匹蒙古馬隨機分為兩組，試驗組8匹，造模組5匹。臨床檢查都在正常參考范圍內，體況檢測合格。用PBS將兩性霉素B稀釋為25 mg/mL。試驗開始前，給馬靜脈注射鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重)和鹽酸地托咪定(0.1μg/kg體重)，進行鎮(zhèn)靜。造模組在馬左側腕關節(jié)內注入2 mL無菌的兩性霉素B稀釋液，誘導馬OA模型。對照組關節(jié)腔注入2 mL無菌的PBS。

1.4 樣品采集及處理 在兩性霉素B給藥之前，收集所有馬左側腕關節(jié)的關節(jié)滑液0.5～1 mL。在整個研究期間每周收集0.5-1 mL滑液樣品，直到第9周。將樣品收集在沒有任何添加劑的EP管中。收集的關節(jié)液1 h內離心15 min(10 000 r/min)，收集上清液，-80 ℃保存待用。從0周到9周每周次分別采用ELISA試劑盒測定造模組和對照組馬關節(jié)滑液中CTX-II含量，嚴格按照ELISA試劑盒商家說明書操作。

1.5 臨床指標的監(jiān)測 每次收集關節(jié)滑液后，記錄馬的直腸溫度，呼吸頻率，脈搏和腕關節(jié)周長，并且進行馬跛行評估，標準參照美國馬獸醫(yī)協(xié)會(AAEP)制定的跛行分級標準[5]進行評分。0級：健康狀態(tài)；1級：不易發(fā)現(xiàn)跛行和行走障礙，間斷性的跛行出現(xiàn)在特定的情況(如負重、轉圈、斜面和硬地面)；2級：不易發(fā)現(xiàn)跛行，但行走異常。持續(xù)性跛行出現(xiàn)在特定的情況(如負重、轉圈、斜面和硬地面)；3級：在任何情況下，都出現(xiàn)明顯的跛行；4級：明顯的跛行，并且伴隨行走點頭和步幅縮??；5級：明顯的跛行，在最小的負重量的情況下，不愿移動或站立。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用Social Sciences 19.0(SPSS Inc. USA)軟件進行統(tǒng)計學分析，結果表示為MEAN±SD表示，使用單因素方差分析和t檢驗進行統(tǒng)計學比較。以P<0.05為差異顯著有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床癥狀 兩性霉素B注射后，造模組和對照組馬的直腸溫度、呼吸、脈搏都在正常的范圍內。對照組的馬在試驗期間沒有出現(xiàn)跛行癥狀，造模組的馬在建立OA模型后的第1、2周表現(xiàn)出1級跛行，在第3、4、5周表現(xiàn)出2級跛行，在第6、7、8 周表現(xiàn)出3級跛行，在第9周表現(xiàn)出5級跛行。對照組的馬關節(jié)周長平均為28.6 cm，在試驗期間沒有明顯變化。造模組馬的關節(jié)周長隨著時間的延長而逐漸增加，第2周開始差異顯著(P<0.05)，第3周至第9周差異極顯著(P<0.01)(見圖1)。

2.2 關節(jié)液CTX-II含量變化 如圖2所示，與對照組相比，造模組從第1周開始，關節(jié)液中CTX-II的含量增加，之后第2周開始顯著增加(P<0.05)，第4周開始呈極顯著增加(P<0.01)并且保持增加的趨勢直到第9周。

圖2 馬關節(jié)液CTX-II濃度(ng/mL)變化

*：差異性顯著(P< 0.05)；**：差異性極顯著(P< 0.01)

3 討論

關節(jié)軟骨是由軟骨細胞及細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)構成的一種無血管、神經、淋巴組織分布的結締組織。ECM主要包括膠原和蛋白多糖兩種物質，II型膠原是構成基質的主要成分，也是維持基質穩(wěn)定的重要成分[6]。因此，II型膠原作為最重要的軟骨成分之一，其代謝產物水平成為監(jiān)測軟骨病理生理的改變研究的熱點之一。CTX-II是一種II型膠原的降解產物，1987年Eyre等[7]在牛關節(jié)軟骨研究中首次發(fā)現(xiàn)，為共價鍵組成的三螺旋片段，可在組織蛋白酶作用下產生小分子多肽。CTX-II完全來自成熟的結構膠原，并以小肽形式全部進入尿液[8]。Lohmander L S等[9]報道在關節(jié)損傷或OA發(fā)病后1周，關節(jié)液中CTX-II的含量就有明顯的升高，最后逐漸下降到一個穩(wěn)定的水平，而且在影像學發(fā)生病變的OA病例以及影像學未發(fā)現(xiàn)的早期OA病例，關節(jié)液中CTX-II的含量都有顯著升高，其中影像學未發(fā)現(xiàn)的早期OA病例相比對照組升高3倍。Jonathan等[10]也報道在急性關節(jié)損傷后，關節(jié)液中CTX-II的含量有顯著的升高。

馬關節(jié)內注射兩性霉素B建立OA模型同手術方法誘導OA模型相比，是具有快速、安全、簡便等優(yōu)點，同時避免了手術創(chuàng)口對試驗的影響[11]。有研究表明，用此種方法成功誘導建立牛和驢的骨關節(jié)炎模型[12]。兩性霉素B引起馬跛行可能是由于其對軟骨基質和滑膜的毒性作用引起炎癥反應以及滑液分泌增多所導致的。OA以往的研究是采用影像學標準對馬匹的病情程度進行評定[3]，然而影像學的改變并不能直觀準確的反映軟骨的病變程度，存在一定的誤差，另外以往的研究中所檢測的樣本為病畜的血液或尿液[13]，這兩種樣本更大程度上反映的是全身性的代謝情況，并不能準確的反映局部關節(jié)軟骨的病變程度，這些都有可能對試驗結果造成影響。所以本研究通過檢測膝關節(jié)液中II型膠原分解代謝產物中CTX-II含量，直接準確的探討關節(jié)液中CTX-II濃度與關節(jié)軟骨病變程度間的關系。在關于人OA的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常關節(jié)相比，患病關節(jié)的關節(jié)液中CTX-II的量明顯增加，而且濃度的增加程度與損傷程度有關[14]。在整個試驗過程中，對照組關節(jié)液內CTX-II濃度無明顯變化，造模組馬關節(jié)液CTX-II濃度在注射兩性霉素B后第2周開始顯著增加(P<0.05)，在整個試驗過程中關節(jié)液CTX-II濃度持續(xù)升高直至第9周試驗結束。造模組在腕關節(jié)注入兩性霉素B后第3周開始出現(xiàn)不同程度跛行，并且CTX-II濃度的升高在跛行前就已經出現(xiàn)了明顯的顯著性升高，這一結果與人OA病變過程中CTX-II變化趨勢相符[14]。本試驗結果早期濃度的顯著性升高證明了軟骨的降解早于臨床癥狀的出現(xiàn)。CTX-II濃度的升高意味著II型膠原的降解，使ECM遭到破壞從而加重OA程度。

綜上所述，推測關節(jié)滑液中的CTX-II可以作為潛在的馬早期骨關節(jié)炎診斷的BM，為以后建立馬骨關節(jié)炎的快速臨床診斷技術提供理論依據(jù)。

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