TLR4在綿羊肺炎支原體介導肺泡上皮細胞凋亡中的作用機理

張俊波 ， 印雙紅 ， 張 紅

(1.銅仁學院農林工程與規(guī)劃學院 銅仁市文化科技產業(yè)創(chuàng)新研究中心 ， 貴州 銅仁 554300 ； 2.浙江大學動物科技學院 ，浙江 杭州 310204 ； 3.銅仁學院大健康學院 ， 貴州 銅仁 554300)

山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP) 在我國流行已久，1947年在甘肅即有本病報道，隨后，內蒙古、四川、山東、云南、江蘇等地都有臨床病例報道[1]。在貴州，2001年萬一元等[2]于羅甸等地分離到絲狀支原體山羊亞種，2011年張雙翔等[3]首次分離到綿羊肺炎支原體。銅仁沿河縣為貴州白山羊的原產地和主產區(qū)，而山羊傳染性胸膜肺炎發(fā)生頻繁，2歲內山羊最易感染，發(fā)病率為37.7%，病死率為36.4%[4]。山羊傳染性胸膜肺炎已成為嚴重危害貴州省養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。

TLRs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類細胞表面的天然免疫受體，是一類高度保守的I型跨膜蛋白，屬模式識別受體，是重要的天然免疫分子[5]，主要表達于免疫細胞和上皮細胞。它通過識別病原微生物的保守分子發(fā)揮著重要的防御作用，激活天然免疫細胞，從而引起一系列的炎癥反應，在機體抵抗病原微生物入侵上發(fā)揮重要作用。TLR樣受體信號通路介導多種生物學效應，如誘導炎癥因子釋放，誘導殺菌活性，促凋亡與抗凋亡作用等。

目前，由于MO對山羊肺泡上皮細胞的作用機理尚不是很清楚，本實驗的目的探討TLR4在綿羊肺炎支原體感染山羊肺泡上皮細胞中作用機制，本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在MO介導山羊肺泡上皮細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，該研究為綿羊支原體肺炎的致病機理研究提供理論基礎和參考意見。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞 綿羊肺炎支原體與山羊肺泡上皮細胞為實驗室保存。

1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；吸水紙、海爾冰箱、清潔無油脂的一次性實驗紙板、記號筆、振動器、自動酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)；燒杯、電子天平、稱量紙、高壓滅菌鍋、燒杯、單道微量移液槍、8道微量移液槍。

1.3 試劑 胎牛血清和DMEM細胞培養(yǎng)液，購自GIBCO公司；酵母提取物、蛋白胨，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；Triton X-100細胞裂解液、MTT試劑盒和DMSO，購自北京索萊寶科技有限公司；Caspase-3/8活性檢測試劑盒和TAK-242抑制劑，購自碧云天生物技術有限公司；SYBR染料，購自羅氏公司。

1.4 方法

1.4.1 MTT實驗 (1)收集對數(shù)期的小鼠腦微血管內皮細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔103-104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積為200 μL，邊緣孔用無菌的PBS填充；(2)置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～24 h使細胞貼壁；(3)將不同濃度的抑制劑Rapamycin(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L)與細胞共同孵育，0.1%DMSO處理的細胞作對照，每組設置5個復孔；(4) 置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～48 h，倒置顯微鏡下觀察；(5)小心吸取上清，加入180 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT(5 mg/mL，即0.5% MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；(6)棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值；(7)同時設置調零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO溶解液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、DMSO溶解液)，每組設定3復孔，細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)× 100%。

1.4.2 實時定量PCR 從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站GenBank上查找公布相關基因設計引物。引物序列見表1。實時定量PCR采用20 μL體系，實時定量PCR采用20 μL體系，PCR反應條件：95 ℃ 5 min變性，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 40個循環(huán)。每組細胞每個時間點的細胞做3個重復，實驗完成后用2-ΔΔCt法對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

表1 引物設計

1.4.3 Caspase3/8活性檢測 (1) 測定pNA標準曲線: ① 標準品稀釋液的配制：按照每0.9 mL檢測緩沖液加入0.1 mL裂解液的比例配制適量的標準品稀釋液；② 把試劑盒提供的pNA (10 mmol/L)用標準品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100 μm和200 μm，作為標準品；③ 每個濃度的標準品稀釋液取100 μL用酶標儀進行檢測，或取用容量不超過100 μL的分光光度檢測杯進行檢測，測定A405;④ 每一個標準品的A405減去空白對照的A405計算出實際的因pNA而導致的吸光度，并制作出A405的標準曲線。

(2) 樣品的收集： ① 抑制劑TAK-242與細胞作用1 h，支原體感染細胞，細菌:細胞按10∶1的個數(shù)比進行感染細胞，并將感染的細胞繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗滌3次。用胰蛋白酶消化貼壁細胞，并收集至細胞培養(yǎng)液以待備用中。600 r/min(4℃)離心5 min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min;② 16 000～20 000 r/min (4℃)離心10～15 min;③ 把離心得到的上清移到冰浴預冷的離心管中;④ 立即測定Caspase3/8的酶活性或-70 ℃保存樣品。

(3) Caspase3/8酶活性的檢測： ①取出pNA和適量的Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)，置于冰浴上備用；②如下(表3)設置反應體系；③加入Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)后混勻，但要避免在混勻時氣泡的產生。37℃孵育時間不定。若發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當延長孵育時間，直到顏色變化明顯為止;④樣品的A405減去空白對照的A405，就是樣品中Caspase3/8催化產生的pNA產生的吸光度。通過步驟(1)中獲得的標準曲線的對比就可以計算出樣品中催化產生了多少量的pNA; ⑤ 參考Chemicon公司的Caspase3/8酶活力單位的定義：一個酶活力單位定義為當?shù)孜镲柡蜁r，在37 ℃1 h內可以剪切1 nmol/L Ac-DEVD-pNA產1 nmol/L pNA的Caspase3/8的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的Caspase3/8;⑥ 用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的DTT，不適合采用BCA法進行蛋白濃度測定)。這樣就可以計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的Caspase3/8的酶活力單位。

表2 反應體系

1.4.4 凋亡率檢測 (1) 抑制劑TAK-242與細胞作用1 h。支原體感染細胞，細菌:細胞按10∶1的個數(shù)比進行侵染細胞，并將侵染的細胞繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗3次;(2) 收集六孔板中的細胞(2 000 r/min離心5 min);(3) 用PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/min離心5 min)收集1～5×105個細胞;(4) 每個樣加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞;(5) 加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；(6) 室溫、避光、反應5～15 min；(7) 利用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

3 結果

3.1 TLR4抑制劑TAK-242對綿羊肺泡巨噬細胞活性的影響 不同濃度抑制劑TAK-242(1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L和30 nmol/L)與細胞作用24 h后，收集細胞，利用MTT方法檢測細胞活性，結果表明，當抑制劑TAK-242濃度為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L不影響細胞活性(圖1)，而在20 nmol/L和30 nmol/L時細胞活性顯著降低(P<0.05)。結果表明，本試驗發(fā)現(xiàn)TAK-242對細胞活性影響具濃度依賴性。

圖1 TAK-242對細胞活性影響

注： 細胞活性在TAK-242組與對照組中的比較； * ：P<0.05

3.2 對不同時間下MO感染肺泡上皮細胞的分析

綿羊肺炎支原體感染肺泡上皮細胞后，提取細胞的總RNA或總蛋白，用實時定量PCR檢測TLR4的mRNA水平。在支原體MOI為10情況下，感染時間為4 h、8 h、12 h和24 h，結果發(fā)現(xiàn)，在12 h和24 h時可以顯著提高TLR4 mRNA表達水平(P<0.01)(圖2)。

圖2 TLR4 mRNA表達水平

3.3 TAK-242對MO介導的Caspase-3和Caspase-8活性的影響 本研究檢測了抑制劑TAK-242對16 mol/L介導的Caspase-3和Caspase-8活性的影響，本研究將TAK-242(10 nmol/L)的抑制劑與細胞提前孵育1 h，再用16 mol/L感染細胞24 h，檢測Caspase-3和Caspase-8的活性，結果顯示，MO可顯著提高Caspase-3和Caspase-8的活性，而TAK-242能夠顯著降低Caspase-3和Caspase-8的活性(P<0.05)(見圖3)，削弱MO對Caspase-3和Caspas-8活性的促進作用。

3.4 TAK-242對MO介導的TNF-α mRNA表達的影響 在感染時間24 h發(fā)現(xiàn)，支原體提高促凋亡基因TNF-α mRNA表達水平，TLR4抑制劑TAK-242在10 nmol/L濃度下可顯著降低支原體介導的TNF-α mRNA表達水平(P<0.01)(圖4)。

圖3Caspase-3和Caspase-8活性變化

注： MO+TAK-242組細胞與MO組細胞的比較；* ：P<0.05

圖4 TNF-α mRNA表達水平

注： MO+TAK-242組細胞與MO組細胞的比較；* ：P<0.01

3.5 TAK-242對MO介導的細胞凋亡率的影響 通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率，結果顯示，在24 h，支原體引起的細胞凋亡率為16.7%±1.81%，抑制劑TAK-242處理組，支原體引起的細胞凋亡率為11.7%±1.32%，經統(tǒng)計學分析，支原體引起的凋亡水平顯著高于正常細胞組(P<0.01)，而抑制劑TAK-242處理顯著降低支原體引起的細胞凋亡水平(P<0.01)。

4 討論

TLRs屬于一種受體，屬于模式識別受體，能夠識別病原的相關分子模式，而且識別的范圍較廣，有脂質類、碳水化合物、脂蛋白和核酸等結構，是連接非特異性免疫和特異性免疫應答的一個橋梁[6]。TLRs是表示一個家族，而TLR4是TLRS其中的成員之一，它是通過活化前炎癥事件的級聯(lián)信號起始對病原生物所進行的應答，而脂多糖是TLR4 配體有效的激動劑[7]。在本試驗中，用不同濃度的抑制劑TAK-242與細胞作用24 h后，收集細胞，利用MTT法檢測細胞活性，結果發(fā)現(xiàn)，當抑制劑TAK-242濃度為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L時并不影響細胞活性，但是在20 nmol/L和30 nmol/L濃度時細胞活性顯著降低。這些結果表明，TAK-242對細胞活性影響具有濃度依賴性。

圖5 TAK-242對MO介導的細胞凋亡率影響

當被感染綿羊肺炎支原體后，就會激起機體內的免疫應答反應[8]，而天然免疫系統(tǒng)又是機體抵御病原微生物入侵體內的第一道防線，其中Toll樣受體(TLR)在其中發(fā)揮著主要作用。當山羊肺泡上皮細胞感染MO的時候，支原體就會激活宿主細胞Toll樣受體(TLR)信號通路,致使細胞釋放大量的腫瘤壞死因子(TNF-α)白細胞介素-1(IL-1)等因子的釋放[9]。在本實驗中，當支原體感染山羊肺泡上皮細胞MOI為10時，在不同時段提取細胞總RNA，實時定量PCR檢測TLR4 mRNA水平，結果發(fā)現(xiàn)，在感染12 h和24 h后可以提高TLR4 mRNA表達水平。且在抑制劑TAK-242的作用下，可以抑制支原體介導的TNF-α mRNA表達水平。

絕大多數(shù)哺乳類動物細胞中都有Caspases家族，在Caspase 級聯(lián)反應中居于重要位置的主導者是Caspase-3與 Caspase-8，是致使細胞發(fā)生凋亡的關鍵步驟和所有凋亡信號傳導的共同通路[10-11]。Caspase-8 是凋亡途徑中的起始因子，可以直接激活下游效應Caspase，比如 Caspase-3。而Caspase-3是處于凋亡級聯(lián)反應的下游，也是細胞程序性死亡的主要效應因子[12]。本試驗結果顯示，MO可顯著提高Caspase-3和Caspase-8的活性，而TAK-242能夠顯著降低Caspase-3和Caspase-8的活性，削弱MO對Caspase-3和Caspase-8活性的促進作用。

正常的細胞都會死亡，其中，根據(jù)細胞死亡過程中的不同表現(xiàn)形式，把細胞死亡分成細胞凋亡和細胞壞死[13]。通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，結果顯示，在24 h，支原體引起的細胞凋亡率為16.7%±1.81%，抑制劑TAK-242處理組，支原體引起的細胞凋亡率為11.7%±1.32%，經統(tǒng)計學分析，支原體引起的凋亡水平顯著高于正常細胞組，而抑制劑TAK-242處理組顯著降低支原體引起的細胞凋亡水平。

[1] 汪代華, 徐剛毅.山羊傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制技術[J].四川畜牧獸醫(yī), 2005,32(10):48-49.

[2] 萬一元, 龍鱉, 萬晴姣，等. 貴州山羊傳染性胸膜肺炎病原的分離鑒定[J].中國草食動物,2001,3(4):44-46.

[3] 張雙翔, 周碧君, 姜漢雯，等. 山羊傳染性胸膜肺炎繼發(fā)大腸埃希氏菌感染的診斷[J]. 貴州農業(yè)科學,2011,39(6):144-146.

[4] 楊光, 李忠全, 崔玉林，等. 貴州白山羊傳染性胸膜肺炎流行病學調查報告[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2012(7):46-49.

[5] O'Neill L A, Golenbock D, Bowie A G. The history of Toll-like receptors-redefining innate immunity[J]. Nat Rev Immunol， 2013, 13(6):453-60.

[6] 徐恩君, 劉亞婷, 李濤.Toll樣受體信號轉導與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展關系的研究進展[J]. 免疫學雜志, 2015,31(8):727-732.

[7] 王振輝, 馬科, 朱曉波, 等.TLR4抑制劑TAK-242對高脂飲食誘導的小鼠胰島素抵抗的干預作用[J].免疫學雜志,2016，32(11):928-934.

[8] Hilliard B,Samoilova E B,Liu T S,etal. Experimental autoimmune encephalomyelitis in NF-kappa B-deficient mice:roles of NF-kappa B in the activation and differentiation of autoreactive T cells[J]. Journal of Immunology,1999, 163(5):2 937-2 943.

[9] 黃亦彤,鐘志勇,呂永慧,等.腸炎清對免疫復合潰瘍型結腸炎模型大鼠結腸組織NF-κB蛋白表達和TLR4、MyD88基因表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志,2016(12):906-910.

[10] Marani M,Tenev T,Hancock D,etal.Identification of novelisoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis [J]. Mol Ceil Biol，2002，22 (11)：3 577-3 589.

[11] 毛德文,陳月橋,王麗，等. Caspase-8及Caspase-3于細胞凋亡[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2008,10(10):148-150.

[12] 曾明,丁媛媛,王金萍，等.可舒膠囊對酒精性肝損傷小鼠肝組織Caspase-3與Caspase-8活性的影響[J].中國醫(yī)藥導報, 2013, 10(27):22-24.

[13] Bin L, Luping D, Bing S,etal.Transcription analysis of the porcine alveolar macrophage response to Mycoplasma hyoneumoniae[J]. Plos one, 2014,9(8):e101968.