天然海水與人工海水對凡納濱對蝦生長及代謝基因表達(dá)的影響

胡利華，查珊潔，劉廣緒，張 敏，王瑤華，肖國強(qiáng)，閆茂倉，黃賢克*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005)

天然海水與人工海水對凡納濱對蝦生長及代謝基因表達(dá)的影響

胡利華1，3，查珊潔2，劉廣緒2，張 敏1，3，王瑤華1，3，肖國強(qiáng)1，3，閆茂倉1，3，黃賢克1，3*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005)

養(yǎng)殖海水的質(zhì)量是影響凡納濱對蝦生殖、發(fā)育、代謝生長的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，因此明確不同養(yǎng)殖海水(天然海水、人工海水)對凡納濱對蝦的影響，對凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。本研究通過養(yǎng)殖試驗(yàn)和熒光定量PCR技術(shù)，對比分析了天然海水、人工海水對雌、雄凡納濱對蝦10個(gè)生長與形態(tài)指標(biāo)的影響，并探討了其對雌、雄凡納濱對蝦關(guān)鍵代謝供能基因己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶(CPT1)表達(dá)的作用。研究結(jié)果表明，在天然海水中養(yǎng)殖的凡納濱對蝦，不論雌雄個(gè)體，其生長指標(biāo)(體長、體重、頭甲長、頭甲寬、軀體周長、肌肉重)均顯著高于人工海水飼養(yǎng)組(P<0.05)。進(jìn)一步的基因表達(dá)分析表明，除了雌性對蝦的IDH基因被誘導(dǎo)表達(dá)之外，人工海水養(yǎng)殖顯著抑制了雌、雄凡納濱對蝦代謝供能基因PK、HK、CPT1的表達(dá)(P<0.05)。

天然海水；人工海水；凡納濱對蝦；生長；代謝供能；基因表達(dá)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，能廣泛適應(yīng)不同鹽度水平，且具有含肉率高、抗逆性強(qiáng)、生長快等優(yōu)點(diǎn)，是目前我國重要的對蝦養(yǎng)殖品種之一[1-3]。近年來，隨著凡納濱對蝦海水淡化養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展，凡納濱對蝦淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到了迅速發(fā)展[4-6]。以沿海省份浙江2014年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為例，淡水養(yǎng)殖凡納濱對蝦產(chǎn)量8.07×104t，遠(yuǎn)高于其海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的3.10×104t。在養(yǎng)殖實(shí)踐中，臨海的凡納濱對蝦繁育與養(yǎng)殖企業(yè)多采用梯度稀釋的天然海水(Natural seawater，NSW)進(jìn)行淡化馴養(yǎng)，而遠(yuǎn)離海岸的內(nèi)陸淡水養(yǎng)殖企業(yè)則多采用人工配制海水進(jìn)行初期穩(wěn)定暫養(yǎng)。因此了解天然海水、人工海水(Artificial seawater，ASW)對凡納濱對蝦的影響，對解決凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中存在的現(xiàn)實(shí)問題具有重要的指導(dǎo)意義[6-8]。

在眾多的指標(biāo)中，生長與形態(tài)性狀既是凡納濱對蝦的經(jīng)濟(jì)評價(jià)指標(biāo)，也是重要的機(jī)體狀態(tài)評價(jià)指標(biāo)[9]，通過生長與形態(tài)指標(biāo)的測定與對比分析，可以較為綜合地反映出不同水體環(huán)境對凡納濱對蝦的影響[10-11]。生物體通過三羧酸循環(huán)、糖酵解和氧化磷酸化等重要的分子通路進(jìn)行三大營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂、蛋白質(zhì))的代謝，從而為正常生命活動(dòng)提供所需的能量供給[12]。己糖激酶(Hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是糖酵解通路中重要的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶[13-14]；異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循環(huán)中的主要限速酶[12，15]；而肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶(Carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)則是在脂肪酸氧化供能中的重要限速酶[12，16]，因此上述基因的表達(dá)可一定程度上在分子層面反映出生物體的代謝水平。

為探明天然海水與人工配制海水對凡納濱對蝦生長形態(tài)性狀和機(jī)體分子代謝的影響，本研究通過生態(tài)養(yǎng)殖試驗(yàn)對比分析了兩種海水對養(yǎng)殖雌、雄凡納濱對蝦體長、體重、頭甲長、頭甲寬、軀體周長、肌肉重等10個(gè)生長形態(tài)指標(biāo)的影響，利用分子生物學(xué)技術(shù)探討了兩種海水養(yǎng)殖對凡納濱對蝦生長影響的分子機(jī)理。本研究結(jié)果將有助于為凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)合理選擇淡化馴養(yǎng)、養(yǎng)殖培育方式提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 凡納濱對蝦的獲得與暫養(yǎng)

體格均一的凡納濱對蝦[體長(9.67±0.3)cm，體重(10.05±0.5)g]取自浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江試驗(yàn)場。凡納濱對蝦在室內(nèi)養(yǎng)殖池內(nèi)暫養(yǎng)7 d后[期間水溫、pH、鹽度分別控制在(28.8±0.6)℃、(8.3±0.2)和(29.8±0.4)]用于養(yǎng)殖試驗(yàn)。馴養(yǎng)期間分別在08∶00，12∶00，16∶00和20∶00四次投喂體重比1/15的沙蠶，并每天換水1次。

1.2 天然海水和人工海水的來源

天然海水來源、取水時(shí)間和水處理方法：2016年7月1日，將樂清灣海區(qū)清江支流的自然海水[鹽度(18±0.6)]在漲潮時(shí)利用水閘抽取至浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江基地蓄水塘，經(jīng)二級砂濾后，再經(jīng)杭州帕爾水處理科技有限公司組裝的海水濃縮裝置后獲得[鹽度(29.8±0.4)]。海水濃縮過濾裝置主要由微濾膜過濾和反滲透膜分離兩部分組成，其具體步驟如表1所示。

表1 海水濃縮裝置

人工海水的配置：將抽取到基地蓄水塘的海水和海水晶配置而成[鹽度(29.8±0.4)]，海水晶成分如表2所示。

1.3 天然海水與人工海水養(yǎng)殖試驗(yàn)

在1 t水體養(yǎng)殖桶內(nèi)分別加入等量的天然海水或人工海水進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。每組試驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行重復(fù)，各放置經(jīng)過暫養(yǎng)的凡納濱對蝦50尾。試驗(yàn)中，每天分四次投喂對蝦體初始體重1/15的活體沙蠶，并換水一次。整個(gè)養(yǎng)殖試驗(yàn)(為期15 d)在相對穩(wěn)定的水體環(huán)境溫度(28.8±0.6)℃、pH(8.3±0.2)條件下進(jìn)行。

表2 海水晶的主要成分

1.4 生長與形態(tài)指標(biāo)的測定

參照董世瑞[17]、吳立峰[18]、柴展[19]等的研究方法，養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，于每平行試驗(yàn)組隨機(jī)選取雌、雄凡納濱對蝦各10尾，先將蝦體用紗布抹干，利用游標(biāo)卡尺和卷尺對其體長、體重、頭甲長、頭甲寬、軀體周長(使用卷尺測量軀體第一節(jié)和最后一節(jié)的周長，求平均值)進(jìn)行測量，然后去除蝦殼、附肢、鰓、胃等非肌肉部分，得到的肌肉用擰干水的紗布吸干后，在電子天平上對其肌肉進(jìn)行稱重，隨后計(jì)算體長/體重(BL/BW)、頭甲長/頭甲重(HL/HW)、頭甲長/體長(HL/BL)和含肉率(肌肉重量占體重的百分比即為含肉率)。

1.5 PK、HK、IDH、CPT1基因表達(dá)熒光定量PCR分析

于每試驗(yàn)組隨機(jī)選取雌、雄凡納濱對蝦各5尾，冰上解剖取肝胰腺與肌肉組織，使用RNAprep Pure組織樣提取試劑盒(Tiangen，DP431)提取組織混合樣總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，C28025-032)制備cDNA模版。使用CFX96TM(Bio-Rad)進(jìn)行熒光定量PCR分析。

表3 PCR及qt-PCR引物的設(shè)計(jì)

10 μL的熒光定量PCR反應(yīng)體系包括了5 μL SsoFastTMEvaGreen Supermix(Bio-Rad，172-5201AP)、2 μL cDNA模版、0.3 μL上下游引物和2.4 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min，94℃ 20 s，61℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)中以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測定基因的相對表達(dá)量用于統(tǒng)計(jì)分析。內(nèi)參β-actin與PK、HK、IDH、CPT1基因引物序列如表3所示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在對生長形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性(Shapiro-Wilk’s test)和方差齊性(Levene’s test)檢驗(yàn)后，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件OriginPro 8.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey HSD檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析前對不滿足正態(tài)性和方差齊性的比例數(shù)據(jù)均預(yù)先進(jìn)行了反正弦轉(zhuǎn)化，所有數(shù)據(jù)在本文中均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的方式表述，并以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著性標(biāo)準(zhǔn)[20]。參照Tallarida與Murray的方法[21]，通過Duncan檢驗(yàn)對相應(yīng)基因表達(dá)進(jìn)行分析，并參照Young等[22]的方法以相對值在結(jié)果中表述。

2 結(jié)果

2.1 天然海水與人工海水對凡納濱對蝦生長形態(tài)指標(biāo)的影響

如表4所示，不同海水養(yǎng)殖對凡納濱對蝦的生長與形態(tài)具有顯著性的影響。天然海水中養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的體長、體重、頭甲長、頭甲寬、肌肉重和軀體周長均顯著優(yōu)于人工海水養(yǎng)殖組。而且天然海水飼養(yǎng)的雌性凡納濱對蝦的體長/體重(BL/BW)顯著小于人工海水養(yǎng)殖試驗(yàn)組(P<0.05)，因此在體型上更為粗壯。此外，天然海水飼養(yǎng)的雄性凡納濱對蝦的頭甲長/體長(HL/BL)顯著高于人工海水養(yǎng)殖試驗(yàn)組(P<0.05)，說明雄性對蝦的頭部發(fā)育在天然海水中更為理想。養(yǎng)殖于天然海水和人工海水中的凡納濱對蝦在頭部形態(tài)(HL/HW)與含肉率上并無顯著差異。

表4 天然海水與人工海水對雌、雄性凡納濱對蝦生長與形態(tài)指標(biāo)的影響

注：不同上標(biāo)表示天然海水與人工海水兩組之間具有顯著性差異，P<0.05。

Note：Different superscript showed significant difference，P<0.05.

2.2 天然海水與人工海水對凡納濱對蝦PK、HK、IDH、CPT1基因表達(dá)的影響

如圖1所示，與天然海水相比，人工海水養(yǎng)殖顯著抑制了雄性凡納濱對蝦關(guān)鍵代謝供能基因丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT1)的表達(dá)。與之類似，雌性凡納濱對蝦PK、HK、CPT1基因在人工海水試驗(yàn)組中的表達(dá)水平也顯著低于天然海水養(yǎng)殖試驗(yàn)組(圖2)。但與雄性對蝦試驗(yàn)結(jié)果不同，雌性對蝦IDH基因的表達(dá)則在人工海水中顯著上調(diào)(圖2)。

注：**表示兩組之間具有顯著差異。

Note：**indicated significant differences atP<0.05.

注：**表示兩組之間具有顯著差異。

Note：**indicated significant differences atP<0.05.

3 討論

為滿足非臨海地區(qū)海水親本培育、育苗、養(yǎng)殖、淡化馴養(yǎng)的需要，人工海水在諸如凡納濱對蝦幼蝦等海水經(jīng)濟(jì)物種的養(yǎng)殖中被廣泛使用。例如，為擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模、避免蝦苗長途運(yùn)輸損失等，崔建榮等[23]、屈銳等[24]分別開展了凡納濱對蝦人工海水育苗養(yǎng)殖的相關(guān)研究，并取得了較好的實(shí)際效果。然而到目前為止，天然海水、人工海水養(yǎng)殖凡納濱對蝦實(shí)際效果的對比分析尚未見報(bào)道。由于人工配制海水在理化與生物特性上與天然海水仍存在一系列的差異[24-25]，因此明確天然海水與人工配制海水在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的不同，對凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中合理選擇親本培育、繁育育苗與淡化馴養(yǎng)方式具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究獲得的試驗(yàn)結(jié)果表明，人工海水養(yǎng)殖的凡納濱對蝦在生長性能上顯著差于天然海水，在分子水平上可能是由于代謝供能基因的表達(dá)受到抑制所致。人工海水養(yǎng)殖的雌性凡納濱對蝦的IDH基因顯著上調(diào)，可能是因?yàn)榇菩詫ξr在發(fā)育過程中能量需求較大，本身糖代謝水平較高，而IDH是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，是催化三羧酸循環(huán)的第二次氧化作用的酶，也是重要的調(diào)節(jié)酶。此酶的活性決定糖的氧化還原及其代謝作用的發(fā)揮，其功能幾乎是不可替代的，另外，在人工海水中，其他能量代謝相關(guān)基因都被抑制，對于IDH可能存在一種補(bǔ)償機(jī)制使其上調(diào)表達(dá)[26-28]。到目前為止，天然海水與人工海水的養(yǎng)殖對比試驗(yàn)仍少有報(bào)道，但王嫣等[29]的研究發(fā)現(xiàn)天然海水飼養(yǎng)的文昌魚(Branchiostomabelcheri)的體長增長率(10.9%)顯著高于人工海水飼養(yǎng)組(7.7%)，說明人工海水抑制海洋物種生長的現(xiàn)象并非個(gè)例。

在本研究中，人工海水和天然海水在理化特性上的不同可能是導(dǎo)致生長性能和分子代謝差異的主要原因[23，25]。一方面，盡管人工海水是在參照天然海水的無機(jī)鹽成分基礎(chǔ)上，模擬天然海水調(diào)配而成，但由于人工海水缺乏天然海水中所含的例如藻多糖、有益微生物、維生素C等生物活性物質(zhì)，因此可能造成凡納濱對蝦養(yǎng)殖中生物環(huán)境條件與營養(yǎng)因子的失衡，進(jìn)而導(dǎo)致其生長和分子代謝受到抑制[30-32]。另一方面，由于用于配制人工海水的海水晶、海鹽在制備過程中普遍采用了蒸發(fā)、濃縮等加工工藝，因此不僅會造成部分微量與痕量元素隨蒸氣流失，并可能使部分金屬陽離子無機(jī)鹽的存在形式發(fā)生改變，從而對所養(yǎng)殖的凡納濱對蝦的生長代謝產(chǎn)生影響[33]。此外，之前的研究還發(fā)現(xiàn)配制的人工海水還普遍存在氨氮、pH偏高的問題[34-35]，因此人工海水可能對養(yǎng)殖的凡納濱對蝦造成環(huán)境壓力，從而使其生長代謝受到抑制。

雖然本研究反映出海水晶配制的人工海水在凡納濱對蝦養(yǎng)殖應(yīng)用中尚存在部分問題，但其關(guān)鍵限制因素尚不明晰，仍需開展進(jìn)一步的研究加以分析驗(yàn)證。在探明人工海水抑制凡納濱對蝦生長代謝關(guān)鍵因子的基礎(chǔ)上，基于之前的研究報(bào)道，通過添加合適的益生菌[36-38]、生物活性物質(zhì)[39-41]、微量元素[42-43]，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)水體氨氮[44]與金屬陽離子(例如Ca2+、Mg2+、K+)濃度[45-46]，并配以均衡的營養(yǎng)飼料[30-32，47-48]，有望解決人工海水抑制凡納濱對蝦生長代謝的問題。

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ImpactsofnaturalseawaterandartificialseawateronthegrowthperformanceandexpressionofmetabolicgenesofPacificwhiteshrimp

HU Lihua1，3，ZHA Shanjie2，LIU Guangxu2，ZHANG Min1，3，WANG Yaohua1，3，XIAO Guoqiang1，3，YAN Maocang1，3，HUANG Xianke1，3*

(1.Zhejiang Mariculture Research Institute，Wenzhou 325005，China；2.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；3.Key Laboratory of Biological Resources Development and Protection in Coastal Waters，Zhejiang Province，Wenzhou 325005)

The quality of seawater is one of the most important environmental factors affecting the reproduction，development，metabolism and growth of Pacific white shrimp(Litopenaeusvannamei).Therefore，knowing the impacts of different types of seawater(natural seawater and artificial seawater)on white shrimp aquaculture will provide important information for the aquaculture industry.In the present study，rearing experiment and qPCR were conducted to investigate the impacts of two types of seawater on the growth performance and expression of metabolic genes of Pacific white shrimp.The results obtained showed thatP.aibuhitensisreared in natural seawater had significantly greater body length，body weight，head length，head width，muscle weight，and body circumference(P<0.05).In addition，except the expression of IDH gene of female shrimps，the gene expression of PK，HK，IDH，and CPT1 were generally depressed in the artificial seawater groups(P<0.05)，which may partially explain the hampered growth performance detected.

natural seawater；artificial seawater；Pacific white shrimp；growth performance；metabolism；gene expression

2017-09-03

浙江省農(nóng)業(yè)(水產(chǎn))新品種選育重大科技專項(xiàng)(2016C2055-5)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017F30043)；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(N20140015)；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(N20150040).

胡利華(1982-)，男，漢族，湖南岳陽人，工程師，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)增養(yǎng)殖研究.E-mail：hulihua1208@163.com

黃賢克(1981-)，男，工程師；研究方向：海水增養(yǎng)殖研究.E-mail：hxkdu@163.com

胡利華，查珊潔，劉廣緒，等.天然海水與人工海水對凡納濱對蝦生長及代謝基因表達(dá)的影響[J].漁業(yè)研究，2017，39(6)：437-443.

S967.9

A

1006-5601(2017)06-0437-07