海洋沉積物中產(chǎn)酶酵母的分離篩選

周治東，駱巧琦，李海平，張躍平，連張飛，張麗艷

(1.福建海洋研究所，福建 廈門 361013；2.福建省海陸界面生態(tài)環(huán)境聯(lián)合重點實驗室，福建 廈門 361005；3.福建省海島與海岸帶管理技術研究重點實驗室，福建 廈門 361013)

海洋沉積物中產(chǎn)酶酵母的分離篩選

周治東1，2，駱巧琦1，2，李海平1，3，張躍平1，2，連張飛1，張麗艷1，3

(1.福建海洋研究所，福建 廈門 361013；2.福建省海陸界面生態(tài)環(huán)境聯(lián)合重點實驗室，福建 廈門 361005；3.福建省海島與海岸帶管理技術研究重點實驗室，福建 廈門 361013)

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)飼料受成本高、品質不穩(wěn)定等因素的影響已經(jīng)不能滿足發(fā)展需求，因而對水產(chǎn)微生物制劑等新型養(yǎng)殖飼料的開發(fā)迫在眉睫。篩選能夠分泌胞外消化酶的酵母菌株對水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的開發(fā)應用具有重要意義。本研究以海洋沉積物為載體，從中分離篩選出能夠分泌胞外消化酶的酵母菌株44株。其中能夠分泌淀粉酶的有15株，能夠分泌蛋白酶的有12株，能夠分泌胞外脂肪酶的有21株，能夠分泌纖維素酶的有14株，而有兩株酵母HY-27與HY-37能夠分泌全部四種消化酶。筆者對這兩株酵母進行了初步鑒定，鑒定結果分別為Sporidioboluspararoseus與Sporobolomycespatagonicus，并將之作為開展微生物制劑后續(xù)研發(fā)工作的重點突破對象。

酵母；淀粉酶；蛋白酶；脂肪酶；纖維素酶；水產(chǎn)養(yǎng)殖

我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量已連續(xù)多年居世界第一，而水產(chǎn)飼料的供應水平是水產(chǎn)養(yǎng)殖的必要條件和物質基礎，被稱作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的糧草。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展一直依賴于飼料行業(yè)的發(fā)展水平。水產(chǎn)動物對飼料蛋白質水平的要求較高，一般要求占配方的25%～50%，為畜禽的2～4倍，甚至更多。飼料中蛋白質的含量與品質不僅決定了飼養(yǎng)動物的生長速度與健康狀況，而且也是水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的重要影響因素之一。因此，蛋白質來源的成本是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料成本的重要組成部分。傳統(tǒng)的魚粉，由于過度捕撈致使多種用于魚粉和魚油生產(chǎn)的水生動物供應數(shù)量急劇下降，加上產(chǎn)品質量參差不齊，遠遠不能滿足我國飼料工業(yè)發(fā)展的需求，因此，探索開發(fā)新型飼料迫在眉睫。單細胞微生物因蛋白質含量高，必需氨基酸含量豐富且組成均衡，正日益成為飼料工業(yè)的研究熱點[1-3]。

益生菌(Probiotics)包括酵母培養(yǎng)物、活菌制劑、微生態(tài)制劑等產(chǎn)品。益生菌具有促進生長、提高飼料利用率、提高抗病力和改善肉質等作用，同時又具備無毒副作用、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性、不污染環(huán)境等抗生素藥物所不具備的優(yōu)點，因此，其被廣泛用作添加劑、水質改良劑[4-7]。為提高水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的利用率及養(yǎng)殖對象的生長效率，研究篩選出能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和胞外纖維素酶的酵母菌株，對水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的應用開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 海洋沉積物

本文所用海洋沉積物均為筆者所在團隊出海時于福建周邊海域利用采泥器采樣所得。采樣方法參照《海洋調(diào)查規(guī)范 第6部分：海洋生物調(diào)查》[8]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離純化基礎培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(W/V)：分別稱取1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖，加經(jīng)過濾的海水配制，121℃高壓滅菌20 min。若配制固體培養(yǎng)基，則加入1.5%瓊脂。

1.2.2 淀粉酶篩選培養(yǎng)基

淀粉酶篩選培養(yǎng)基(W/V)：分別稱取1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%可溶性淀粉、1.5%瓊脂，用過濾海水配制，121℃高壓滅菌20 min。

碘原液：分別稱取0.5 g碘結晶和5.0 g碘化鉀加蒸餾水溶解并定容至100 mL。

1.2.3 蛋白酶篩選培養(yǎng)基

蛋白酶篩選培養(yǎng)基(W/V)：分別稱取1%酵母提取物、2%脫脂奶粉、1.5%瓊脂，用過濾海水配制，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.4 脂肪酶篩選培養(yǎng)基

脂肪酶篩選培養(yǎng)基(W/V)：取1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%吐溫80、1.5%瓊脂，用過濾海水配制，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.5 纖維素酶篩選培養(yǎng)基

纖維素酶篩選培養(yǎng)基(W/V)：取1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，用過濾海水配制，121℃高壓滅菌20 min。

剛果紅溶液配制：配制質量濃度為10 mg/mL的剛果紅溶液，滅菌后，按照每200 mL培養(yǎng)基加入1 mL的比例加入剛果紅溶液，混勻后倒平板。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

采用稀釋涂布平板法，分別稱取1.0 g沉積物樣品，以10 mL無菌海水懸浮混勻，取100 μL混勻液均勻涂布于YPD培養(yǎng)基平板上。于28℃培養(yǎng)7～15 d后，根據(jù)菌落形態(tài)進行簡單歸類，挑取不同類型菌落劃線純化至形態(tài)單一后，保種。

1.3.2 產(chǎn)酶菌株篩選

將待測酵母菌株在YPD 培養(yǎng)基上活化后，用牙簽挑取單菌落畫小圓圈接種于相應篩選培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7～15 d后，觀察形成透明圈的情況或是加入特定試劑進行顯色實驗。

1.3.3 菌株鑒定

酵母菌于YPD平板28℃培養(yǎng)48 h，采用CTAB法提取酵母菌DNA[9]，擴增ITS序列，引物選用ITS5(5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3’)[10]。反應在50 μL體系中進行，體系含有 10×buffer 5 μL、 MgCl22 mmol/L、dNTP 400 μmol/L、ITS5 10 pmol、ITS4 10 pmol、DNA模板2 μL(約50～200 ng)、Taq聚合酶4 U，以及ddH2O 23.2 μL。反應程序為：95℃預變性4.0 min，進入循環(huán)，95℃變性1.5 min，52℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min，36個循環(huán)，最后72℃延伸10 .0 min，4℃保存。用吸附柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒(OMEGA公司)純化PCR產(chǎn)物，純化的PCR產(chǎn)物在上海美吉公司測序。

1.3.4 系統(tǒng)進化樹分析

測得的序列去除載體后用BLASTn在NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對。把ITS同源性≥98% 的序列歸為一個種系型(Nilsson等報道子囊菌ITS 序列的種間差異為1.96%[11])，每種種系型選擇一個序列作為代表，用 Clustal X 軟件[12]進行完全比對。利用 MEGA(Molecular evolutionary genetics analysis[13])軟件的鄰位加入法(Neighbor-joining method，NJ)建立系統(tǒng)進化樹，同時使用1 000次重復的自展分析(Bootstrap analysis，BA)來檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可信度。

2 結果與討論

2.1 沉積物樣品中酵母菌的分離純化

對海洋沉積物樣品進行酵母菌的分離培養(yǎng)實驗，劃線純化后共得到不同形態(tài)的酵母菌株44株(表1)。

表1 酵母菌株分離純化信息匯總

2.2 淀粉酶篩選結果

采用淀粉酶篩選培養(yǎng)基對44株酵母菌接種培養(yǎng)7～15 d，用碘液進行顯色反應后，篩選出15株酵母可分泌體外淀粉酶(表2)。其中HY-33、HY-27、HY-28、HY-21四株酵母菌產(chǎn)生的透明圈較大。部分產(chǎn)淀粉酶菌株實驗效果如圖1所示。

表2 淀粉酶分泌菌株篩選結果

續(xù)表2

注：透明圈直徑與菌體直徑差值1～5 mm范圍內(nèi)用+；5～10 mm范圍內(nèi)用++；>10 mm范圍用+++。

Notes：The difference between transparent circle diameter and the cell diameter in the range of 1～5 mm used +， 5～10 mm used++，range for>10 mm used +++.

注：a為產(chǎn)淀粉酶菌株HY-21，其實驗結果顯示陽性；b為不產(chǎn)淀粉酶菌株，顯示陰性。

Notes：Picture a was strain HY-21 producing amylase，and its experimental result was positive.Picture b was a strain not producing amylase，showing negative result.

2.3 蛋白酶篩選結果：

采用蛋白酶篩選培養(yǎng)基對44株酵母菌進行培養(yǎng)7～15 d，發(fā)現(xiàn)有12株酵母能夠分泌胞外蛋白酶(表3)，觀察可知菌株HY-27與HY-39產(chǎn)生的透明圈較大。圖2列舉了部分產(chǎn)蛋白酶菌株的實驗效果。

表3 蛋白酶分泌菌株篩選結果

注：透明圈直徑與菌體直徑差值1～5 mm范圍內(nèi)用+；5～10 mm范圍內(nèi)用++；>10 mm范圍用+++。

Notes：The difference between transparent circle diameter and the cell diameter in the range of 1～5 mm used+， 5～10 mm used++，range for>10 mm used+++.

注：a圖為產(chǎn)蛋白酶菌株(箭頭指向菌株HY-27水解圈外緣)，b圖箭頭指向不產(chǎn)蛋白酶菌株。

Notes：Picture a was strains HY-27 producing protease(arrow pointing to the outer hydrolysis ring)，arrow of picture b pointing to the strain which couldn’t produce protease.

2.4 脂肪酶篩選結果：

采用脂肪酶篩選培養(yǎng)基對44株酵母菌培養(yǎng)7～15 d，發(fā)現(xiàn)有21株酵母能夠分泌胞外脂肪酶(表4)，觀察可知HY-10、HY-32、HY-13、HY-15四株產(chǎn)淀粉酶渾濁圈較大。部分產(chǎn)脂肪酶菌株實驗效果如圖3所示。

表4 脂肪酶分泌菌株篩選結果

注：渾濁圈直徑與菌體直徑差值1～5 mm范圍內(nèi)用+；5～10 mm范圍內(nèi)用++；>10 mm范圍用+++。

Notes：The difference between turbid circle diameter and the cell diameter in the range of 1～5 mm used+， 5～10 mm used++，range for>10 mm used+++.

注：a圖箭頭指向產(chǎn)酶菌株HY-10混濁圈外緣，b圖為不產(chǎn)淀粉酶菌株。

Notes：Arrow of picture a was pointing to the turbid ring edge of strain HY-10 producing enzyme，picture b was a strain not producing amylase.

2.5 纖維素酶篩選結果：

采用脂肪酶篩選培養(yǎng)基對44株酵母菌進行培養(yǎng)7～15 d，觀察可知有14株酵母能分泌胞外纖維素酶(表5)，測量發(fā)現(xiàn)菌株HY-39與HY-29產(chǎn)生的透明圈較大。圖4顯示了部分菌株的篩選實驗結果。

表5 纖維素酶分泌菌株篩選結果

注：透明圈直徑-菌體直徑差值1～5 mm范圍內(nèi)用+；5～10 mm范圍內(nèi)用++；>10 mm范圍用+++。

Notes：The difference between transparent circle diameter and the cell diameter in the range of 1～5 mm used+， 5～10 mm used++，range for>10 mm used+++.

注：a圖中箭頭所指向菌落為產(chǎn)胞外纖維素酶菌株HY-26，b圖箭頭指向不產(chǎn)胞外纖維素酶菌株。

Notes：Arrow of picture a was pointing to the enzyme producing strain HY-26，picture b was a strain not producing extracellular cellulase.

2.6 四種消化酶酶篩選結果匯總

對消化酶篩選實驗的結果進行匯總，統(tǒng)計顯示所純化出的酵母菌株中有2株能夠分泌4種消化酶，8株可分泌3種消化酶，7株可分泌2種酶，其中 HY-27和HY-37可分泌四種酶(表6)。

表6 分泌兩種以上消化酶菌株篩選結果匯總

注：透明圈(渾濁圈)直徑-菌體直徑差值1～5 mm范圍內(nèi)用+；5～10 mm范圍內(nèi)用++；>10 mm范圍用+++；-表示陰性。

Notes：The transparent circle(turbid ring)diameter and the cell diameter difference in the range of 1～5 mm used+， 5～10 mm used++，range for>10 mm used+++，enzyme producing negative used -.

2.7 對HY-27與HY-37的菌種初步鑒定

經(jīng)引物擴增兩株目標菌種的ITS序列后測序，測得的序列去除載體后用BLASTn在NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，從中選出同源性較高的菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。通過系統(tǒng)發(fā)育樹比較，HY-27與Sporidioboluspararoseus聚為同一分支，且相似度高達100%；HY-37與Sporobolomycespatagonicus聚為同一分支，相似度高達99%。因此，可將HY-27初步鑒定為Sporidioboluspararoseus，HY-37初步鑒定為Sporobolomycespatagonicus。

3 討論

眾所周知，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大。為了防止養(yǎng)殖過程中病害的暴發(fā)，抗生素被大量使用。但是抗生素導致耐藥性的產(chǎn)生及殘留藥物通過食物鏈影響人類健康等問題日益突出。因此，尋找新型環(huán)保的抗生素替代品成為了當下的研究熱點[14-16]。益生菌作為替代抗生素成為新型的飼料添加劑，受到人們的廣泛關注。研究表明，益生菌具有增強養(yǎng)殖動物免疫力、促進餌料的消化吸收、改善養(yǎng)殖環(huán)境等作用。益生菌本身無毒無害，不殘留，不產(chǎn)生抗藥性，是未來水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的應用研究重點[6，16-19]。酵母作為益生菌的一種，已廣泛應用于生產(chǎn)實踐當中。酵母培養(yǎng)物是一種酵母發(fā)酵產(chǎn)品，包括酵母菌細胞、代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基三個組成部分，含有豐富的營養(yǎng)物質。酵母培養(yǎng)物可作為一種微生態(tài)制劑，用來調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物腸道的微生態(tài)平衡，從而提高水產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能。如酵母菌的細胞壁(β-葡聚糖和甘露寡糖)與胞溶性物質(蛋白質、維生素、核酸、消化酶、促生長因子和較齊全的氨基酸)具有良好的適口性和免疫促生長作用，對水產(chǎn)動物來說是集營養(yǎng)、防御病害為一體的飼料添加劑。已有研究表明酵母可以促進虹鱒的生長發(fā)育和免疫保護[20]；促進羅非魚的生長、提高存活率和免疫力[21]。酵母，一方面可以作為飼料提供營養(yǎng)，也叫飼料酵母；另一方面可以改善宿主腸道內(nèi)消化酶活性，幫助消化。酵母在液態(tài)培養(yǎng)基中大量生長繁殖，生產(chǎn)單細胞蛋白。酵母細胞中富含蛋白質、核酸、維生素、多種消化酶，能促進動物的消化吸收，提高飼料利用率，促進生長。

為了提高水產(chǎn)養(yǎng)殖中飼料的利用率及養(yǎng)殖對象生長效率，研究篩選能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及胞外纖維素酶的酵母菌株，這對水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的應用開發(fā)具有重要意義。本文以福建省近海沉積物為來源，分離純化出44株不同形態(tài)的酵母菌株，并對所得菌株體外消化酶(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶)分泌情況進行了篩選，發(fā)現(xiàn)兩株酵母(HY-27與HY-37)具有分泌全部四種酶的能力。對這兩株酵母菌株擴增ITS序列并測序后構建系統(tǒng)進化樹，將HY-27與HY-37初步鑒定為Sporidioboluspararoseus和Sporobolomycespatagonicus。接下來的工作還將結合生產(chǎn)，對產(chǎn)酶菌株與宿主之間的作用機制進行進一步地探索，了解菌株在養(yǎng)殖實踐中的實際作用效果，從而達到將之應用于生產(chǎn)實踐的最終目的。

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Screeningofmarineenzymeproducingyeastanditsapplicationinaquaculture

ZHOU Zhidong1，2， LUO Qiaoqi1，2，LI Haiping1，3，ZHANG Yueping1，2，LIAN Zhangfei1，ZHANG Liyan1，3

(1.Fujian Institute of Oceanology，Xiamen 361013，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Coastal Ecology and Environmental Studies，Xiamen 361005，China；3.Fujian Provincial Key Laboratory of Coast and Island Management Technology Study，Xiamen 361013，China)

With the continuous development of aquaculture in our country，the traditional feed have been unable to meet the development needs of aquaculture due to its high cost，unstable quality and other factors.It is urgent to develop new type feed for aquaculture microorganism preparation.Screening yeast strains which are capable of secreting extracellular digestive enzymes are of great significance for the development and application of aquaculture.In this study，44 strains of yeast strain which cowld secrete extracellular digestive enzymes were isolated and screened from marine sediments.Among them，there were 15 strains which could produce amylase，12 strains could secrete protease，21 strains could secrete extracellular lipase，and 14 strains could secrete cellulase.It was worth mentioning that there were two yeast of HY-27 and HY-37 could secrete all four digestive enzymes，then the author conducted a preliminary identification of the two strains of yeast.the identification results wereSporidioboluspararoseus(HY-27) andSporobolomycespatagonicus(HY-37).

yeast；amylase；protease；lipase；cellulase；aquiculture

2017-09-15

福建省公益類科研院所專項(2014R1006-7、2015R1006-3)；福建省海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目(2014FJ-16)；“十三五”廈門市海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展示范項目(16PZY002SF-18).

周治東(1985-)，男，遼寧省遼陽市人，助理研究員，碩士，從事海洋生物學研究.E-mail：nirvananan@163.com

周治東，駱巧琦，李海平，等.海洋沉積物中產(chǎn)酶酵母的分離篩選[J].漁業(yè)研究，2017，39(6)：444-454.

Q933

A

1006-5601(2017)06-0444-11