20AA復(fù)方氨基酸聯(lián)用大劑量維生素B6對(duì)密閉艙室煙霧吸入性肺損傷救治效果研究

孫磊 蔡穎 敖琳 劉晉祎 陶成玉 岳茂興 曹佳

·論著·

20AA復(fù)方氨基酸聯(lián)用大劑量維生素B6對(duì)密閉艙室煙霧吸入性肺損傷救治效果研究

孫磊1蔡穎1敖琳1劉晉祎1陶成玉2岳茂興3曹佳1

目的探討20AA復(fù)方氨基酸注射液(豐諾安)聯(lián)用大劑量維生素B6新療法對(duì)密閉艙室煙霧吸入性肺損傷的救治效果。方法將48只清潔級(jí)雄性SD大鼠完全隨機(jī)分為正常對(duì)照組、損傷對(duì)照組及救治組，每組16只，分別為：正常對(duì)照組自由呼吸新鮮空氣，腹腔注射70 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)3 d；損傷對(duì)照組以只鼻染毒的方式吸入煙霧10 min后，腹腔注射70 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)3 d；治療組以口鼻染毒的方式吸入煙霧10 min后，腹腔注射50 mL/kg豐諾安注射液及50 mg/mL維生素B61g/kg，連續(xù)3 d。觀察死亡率，進(jìn)行大鼠肺功能檢測(cè)、肺大體病理觀察及肺水含量測(cè)定。結(jié)果煙霧吸入后動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的呼吸困難及精神神經(jīng)癥狀。與損傷對(duì)照組比較，治療組大鼠死亡率增加(60% vs 40%)，兩組大鼠生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.684,P>0.05)。煙霧染毒后大鼠肺大體表現(xiàn)為明顯的肺水腫和彌漫性出血，救治組肺出血及水腫程度輕于損傷對(duì)照組；損傷對(duì)照組大鼠肺干濕比顯著高于正常對(duì)照組[(5.02±0.13) vs (4.71±0.13),P<0.01]，治療組大鼠肺干濕比顯著低于損傷對(duì)照組[(4.76±0.18) vs (5.02±0.13),P<0.05]；損傷組大鼠肺功能PAU顯著高于正常對(duì)照組[(1.93±0.58) vs (1.33±0.17),P<0.05]，治療組大鼠PAU、EF50顯著低于損傷對(duì)照組[(1.29±0.43) vs (1.93±0.58),P<0.05;(0.58±0.15) mL/sec vs (1.19±0.40) mL/sec,P<0.05]。結(jié)論豐諾安聯(lián)用大劑量維生素B6能夠明顯緩解煙霧吸入導(dǎo)致肺損傷，改善肺功能，但大鼠可能由于不能耐受腹腔注射臨床劑量的聯(lián)用藥物，從而導(dǎo)致死亡率增加。

密閉艙室； 煙霧吸入； 急性肺損傷； 復(fù)方氨基酸注射液(20AA)； 維生素B6

火災(zāi)中85%以上的死亡者是由煙霧吸入引起的[1]。坦克艙室內(nèi)使用了大量的非金屬材料,在戰(zhàn)斗中一旦中彈起火,會(huì)產(chǎn)生大量的有毒有害煙霧,煙霧吸入后以急性肺損傷為主要損害特征[2-3]。目前的煙霧模擬染毒實(shí)驗(yàn)研究雖然已經(jīng)篩選出多種救治藥物，能夠明顯緩解動(dòng)物煙霧吸入導(dǎo)致的急性肺損傷[4-6],但是在臨床治療實(shí)踐中其療效尚不明確。豐諾安聯(lián)合大劑量維生素B6是目前在臨床上用于救治急重癥患者的一種新的療法,該療法經(jīng)大量臨床病例證實(shí)對(duì)化學(xué)性肺水腫、肝衰竭及重度凝血功能障礙等重癥具有顯著的療效[7-9]。筆者在前期的研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討豐諾安聯(lián)合大劑量維生素B6新療法對(duì)坦克艙室煙霧吸入性肺損傷的救治效果,為深入開展機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康清潔級(jí)雄性SD大鼠48只,7～9周齡,體重200～250 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物使用合格證號(hào):SCXK(渝)20131018],常規(guī)飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所動(dòng)物房。將48只SD大鼠普通基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,每組16只,進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2.主要試劑:維生素B6注射液:0.1 g/支(2 mL),石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司。復(fù)方氨基酸注射液(20AA):豐諾安注射液,50 g總氨基酸(500 mL),辰欣藥業(yè)股份有限公司。復(fù)方氯化鈉注射液:0.9%等滲鹽水,四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

3.主要實(shí)驗(yàn)儀器:HOPE-MED 8504型密閉艙室煙霧模擬染毒實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(天津合普公司)，120A型電子分析天平(瑞士Drecisa公司)，WBP小動(dòng)物肺功能儀(美國(guó)BUXCO公司)，LS-O410恒溫烤箱(美國(guó)Fisher Scientific公司)。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模和治療方法

根據(jù)參考文獻(xiàn)[2],將動(dòng)物置于口鼻染毒箱內(nèi),口鼻染毒箱放置在密閉艙室煙霧模擬染毒實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中,動(dòng)物適應(yīng)10 min。將裁剪好的艙室條狀非金屬材料36 g鋪設(shè)在石英加熱管內(nèi),調(diào)節(jié)發(fā)煙溫度至500℃、燃燒步進(jìn)速度為1.0 cm/min、進(jìn)氧流量為0.5 m3/h、染毒艙氣壓為-60 Pa。待口鼻染毒箱內(nèi)的煙霧分布均勻后,動(dòng)物開始染毒并計(jì)時(shí),連續(xù)染毒10 min。染毒結(jié)束后將動(dòng)物取出放回飼養(yǎng)籠中,置于開放環(huán)境中呼吸新鮮空氣,自由飲食和飲水。動(dòng)物分組與治療方法如下:

正常對(duì)照組：在實(shí)驗(yàn)過程中自由呼吸新鮮空氣,每日腹腔注射70 mL/kg的0.9%氯化鈉注射液(于每天9∶00、14∶00、19∶00平均分3次完成注射),連續(xù)3 d;損傷對(duì)照組以口鼻染毒方式吸入煙霧10 min后,從染毒當(dāng)日開始每天腹腔注射70 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液(于每天9∶00、14∶00、19∶00平均分3次完成注射),連續(xù)3 d;治療組以口鼻染毒的方式吸入煙霧10 min后,從染毒當(dāng)日開始每天腹腔注射50 mL/kg豐諾安注射液及50 mg/mL的維生素B6(1 g/kg,于每天9∶00、14∶00、19∶00平均分3次完成注射),連續(xù)3 d。

三、觀察指標(biāo)

1.死亡率及生存時(shí)間測(cè)定:從每組中隨機(jī)選擇10只動(dòng)物,觀察染毒后3 d內(nèi)各組動(dòng)物的中毒反應(yīng)、死亡情況及生存時(shí)間。

2.肺功能測(cè)定:在染毒后第4天,將每組剩余6只大鼠分別置于WBP小動(dòng)物肺功能儀(美國(guó)BUXCO公司)中,檢測(cè)如下指標(biāo):呼吸頻率(f)、潮氣量(TVb)、每分鐘通氣量(MVb)、呼吸間歇(PAU)、增強(qiáng)型呼吸間歇(Penh)、呼吸中期流速(EF50)。

3.肺大體病理觀察:肺功能測(cè)定結(jié)束后,將大鼠常規(guī)麻醉后股動(dòng)脈放血處死,立刻分離肺臟組織,肉眼觀察肺臟出血及水腫情況。

4.肺水含量測(cè)定:取各組大鼠右肺中葉,吸水紙吸干表面水分及血液,稱重。然后置于80℃烤箱,72 h后稱量肺干重,計(jì)算肺干濕比(wet and dry weight ration,W/D)[10]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、動(dòng)物中毒情況

煙霧吸入過程中,動(dòng)物立刻出現(xiàn)呼吸節(jié)律加快,動(dòng)物表現(xiàn)為掙扎和煩躁,部分動(dòng)物尾部僵直。染毒結(jié)束后部分動(dòng)物死亡,存活動(dòng)物均出現(xiàn)較嚴(yán)重呼吸困難,肺部可聞及水泡音。動(dòng)物伏地不動(dòng),尾部僵直,部分昏迷或休克,甚至抽搐,四肢濕冷,口唇紫紺,感覺和運(yùn)動(dòng)障礙。眼球顏色變?yōu)榈t色,眼睛紅腫、流淚、畏光。煙霧吸入24 h后,大部分動(dòng)物上述癥狀基本消失,可自由活動(dòng)、進(jìn)食和飲水。

二、動(dòng)物死亡率及生存時(shí)間

染毒10 min后,3 d觀察時(shí)間內(nèi),損傷對(duì)照組動(dòng)物死亡率為40%,治療組動(dòng)物死亡率為60%,正常對(duì)照組動(dòng)物無死亡(圖1)。三組間動(dòng)物生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.320,P<0.05),其中損傷組和治療組與對(duì)照組比較生存時(shí)間顯著降低(χ2=4.750,P<0.05;χ2=6.401,P<0.05),治療

組與損傷對(duì)照組比較動(dòng)物生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.684,P>0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠死亡率

圖2 各組大鼠生存曲線圖

三、肺大體病理觀察

正常對(duì)照組大鼠肺大體形態(tài)正常,肺表面無明顯的出血和水腫;煙霧染毒后大鼠肺大體病理改變主要表現(xiàn)為肺水腫和彌漫性出血。其中救治組的肺出血及水腫程度輕于損傷對(duì)照組。見圖3。

四、肺水含量測(cè)定

三組間動(dòng)物肺濕干比有顯著差異(F=7.383,P<0.001)。其中,損傷對(duì)照組動(dòng)物肺干濕比與正常對(duì)照組顯著增加(P<0.001),治療組肺干濕比與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與損傷對(duì)照組比較,治療組肺干濕比顯著降低(P<0.05)。見表1。

五、肺功能測(cè)定

治療組呼吸頻率顯著低于正常對(duì)照組和損傷對(duì)照組(P<0.01),治療組MVb顯著低于正常對(duì)照組和損傷對(duì)照組(P<0.05);損傷對(duì)照組Penh顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01);損傷對(duì)照組PAU顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05),治療組PAU顯著低于損傷對(duì)照組(P<0.05);治療組EF50顯著低于損傷對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

注：a為對(duì)照組;b為損傷對(duì)照組;c為治療組

圖3 各組大鼠肺大體病理改變表1 各組大鼠肺水含量變化

注：P0為三組間比較的P值,P1為損傷對(duì)照組與正常對(duì)照組比較的P值，P2為治療組與正常對(duì)照組比較的P值，P3為治療組與損傷對(duì)照組比較的P值。W/D為肺干濕比

討 論

吸入性損傷是目前火災(zāi)燒傷病人死亡最常見的原因。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,火災(zāi)中85%以上的死亡者是由于煙霧的影響,其中大部分是吸入煙塵及有毒氣體昏迷后而致死的[1]。顆粒物、有毒氣體及缺氧環(huán)境共同作用,往往使肺部損傷急劇惡化,給傷員的救治帶來極大的困難。近年來,隨著對(duì)急性煙霧吸入性肺損傷病理生理學(xué)研究的發(fā)展,人們提出了一系列的特異性的綜合救治措施,這些措施雖然大多在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究方面取得了明顯的療效[4-6],但是在煙霧吸入病人的臨床救治中其療效卻未能被證實(shí)。

近年來,20AA高支鏈復(fù)合氨基酸豐諾安聯(lián)用大劑量維生素B6新療法被廣泛應(yīng)用于臨床危重病癥的救治[7-9]。大量的臨床病例證實(shí),新療法對(duì)于重度化學(xué)性肺水腫、重癥肝功能障礙、肝性腦病及嚴(yán)重凝血功能障礙燈危重病癥均有明確的療效。但其機(jī)制目前還不清楚。人體正常生命代謝活動(dòng)的二大循環(huán)是三羧酸循環(huán)及鳥氨酸循環(huán),當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷或大手術(shù)打擊下,人體正常的二大循環(huán)功能將受到影響。而豐諾安(20AA高支鏈肝病復(fù)方氨基酸) 由20種氨基酸配制而成,主要用來預(yù)防和治療肝性腦病、肝病或肝性腦病急性期的靜脈營(yíng)養(yǎng),并提供了機(jī)體代謝的底物。它不僅能糾正支鏈氨基酸和芳香氨基酸代謝的失衡[11],還能抑制大腦中假性神經(jīng)遞質(zhì)的形成,并能改善肝性腦病。豐諾安中的L-鳥氨酸能夠迅速穿透線粒體膜,在線粒體內(nèi)通過代謝,攜帶一分子二氧化碳和一分子氨,轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-瓜氨酸,并又迅速穿過線粒體,配合L-天冬氨酸,即能迅速激活肝細(xì)胞內(nèi)的尿素循環(huán),將機(jī)體在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷或大手術(shù)打擊下產(chǎn)生的有害的二氧化碳及氨通過鳥氨酸代謝(尿素循環(huán))排出體外,從而使得肝內(nèi)酶代謝逐步恢復(fù),凝血因子又得以產(chǎn)生,迅速恢復(fù)內(nèi)源性凝血途徑,同時(shí)還提供了機(jī)體代謝的底物[12]。大劑量維生素B6是人體各種氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA) 和谷氨酸(Glu)的輔酶,現(xiàn)已知肝臟有60多種酶需要維生素B6參與,配合維生素C,能夠清除MODS產(chǎn)生的有害自由基,能迅速降低自由氧基對(duì)臟器的毒害。能促進(jìn)酶代謝的恢復(fù)。大劑量維生素B6還是天然的利尿劑,維生素B6在體內(nèi)半衰期短,很快排出體外,有1例患者連續(xù)靜脈輸入維生素B6在5 636支,另外在岳茂興等[8]臨床應(yīng)用的20 000多例患者中,沒有1例發(fā)生過量事件。

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)改變情況

注：P0為三組間比較的P值,P1為損傷對(duì)照組與正常對(duì)照組比較的P值;P2為治療組與正常對(duì)照組比較的P值;P3為治療組與損傷對(duì)照組比較的P值;f為呼吸頻率，TVb為潮氣量，MVb為每分鐘通氣量，Penh為增強(qiáng)型呼吸間歇，PAU為呼吸間歇，EF50為呼吸中期流速

本研究將臨床上已被證實(shí)對(duì)多種重癥疾病有明確療效的新療法用于煙霧吸入性肺損傷的救治研究,初步觀察其救治效果。結(jié)果顯示,給予實(shí)驗(yàn)大鼠臨床劑量的豐諾安及維生素B6,動(dòng)物的肺大體病理改變明顯減輕,表現(xiàn)為肺水腫及肺出血減少。同時(shí)治療組肺W/D顯著低于損傷對(duì)照組,也進(jìn)一步證實(shí)了新療法能夠明顯減輕煙霧吸入導(dǎo)致的肺水腫程度。PAU用來量化動(dòng)物呼吸困難時(shí)支氣管收縮的嚴(yán)重程度[13],能夠真實(shí)反映出呼吸道的阻塞程度[14-15]。本研究結(jié)果顯示,動(dòng)物給予新療法處理后,其PAU顯著低于損傷對(duì)照組,說明新療法能夠明顯減輕煙霧吸入導(dǎo)致呼吸道阻塞及支氣管收縮的嚴(yán)重程度,對(duì)肺功能具有明顯的改善作用。通過以上結(jié)果初步證實(shí)了,豐諾安聯(lián)合大劑量維生素B6對(duì)煙霧吸入性肺損傷具有明顯的救治效果。

但是通過死亡率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),治療組動(dòng)物的死亡率不但沒有明顯改善,反而顯著升高。究其原因可能是實(shí)驗(yàn)中給予動(dòng)物的藥物用量過大造成動(dòng)物無法耐受而加重死亡的。按照動(dòng)物種屬將臨床用藥劑量進(jìn)行換算后,每天給予大鼠的實(shí)際腹腔注射的藥物體積約為14 mL,而文獻(xiàn)報(bào)道的大鼠腹腔注射的最大耐受劑量約為3 mL。即便將新藥分3次注射,其用量也遠(yuǎn)超過動(dòng)物的耐受劑量。豐諾安是一種較高濃度的復(fù)合氨基酸注射液,大量的豐諾安注射到動(dòng)物腹腔后很可能造成腹腔的大量腹水或持續(xù)炎癥,同時(shí)膈肌上抬,限制了肺的正常擴(kuò)張,影響通氣功能。本研究結(jié)果也證實(shí),救治組每分鐘通氣量顯著低于損傷對(duì)照組及正常對(duì)照組,說明新藥注射后明顯影響的動(dòng)物的通氣功能。這可能是新療法造成死亡率增加的一個(gè)重要原因。本研究提示,在下一步實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)該適當(dāng)減少藥物劑量或者使用更高濃度的濃縮劑型,如有可能也可以選擇兔子或其他較大型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用靜脈滴注的方式給藥。

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Effectofnewtherapyof20AAcompoundaminoacidplushighdoseofvitaminB6onacutelunginjuryinducedbysmokeinhalationinairtightcabins

SunLei1,CaiYing1,AoLin1,LiuJinyi1,TaoChengyu2,YueMaoxing3,CaoJia1.

1InstituteofToxicology;ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2DepartmentofAmbulantClinic,PLAAcademyofArmoredForces,Bengbu233010,China;3SpecialMedicalCenter, 306thHospialofPLA,Beijing100101,China

CaoJia,Email:caojia1962@126.com

ObjectiveTo evaluate the effect of a new therapy of 20AA compound amino acid injection plus high-dose vitamin B6on acute lung injury induced by smoke inhalation in airtight cabins.MethodsA total of 48 male SD rats were randomly divided into control group, injury group and treatment group, with 16 rats per group. Rats in the control group inhaled the fresh air freely and were injected intraperitoneally with 70 mL/kg physiological saline for three days. Rats in the injury group were injected intraperitoneally with 70 mL/kg physiological saline for three days after nose-only smoke inhalation for 10 minutes. Rats in the treatment group were injected intraperitoneally with 50 mL/kg 20AA compound amino acid injection plus 1 g/kg vitamin B6(50 mg/mL) for three days after nose-only smoke inhalation for 10 minutes. Survival time and poisoning manifestations, lung function, pathological changes and lung wet-to-dry weight (W/D) ratio were observed and compared in three group.ResultsAfter smoke inhalation, breathing difficulties and some mental symptoms were observed immediately. Compared with the injury group, the mortality in the treatment group was increased (60% vs 40%),while the difference of survival time between the injury group and treatment group was not statistically significant (χ2=0.684,P=0.165). Lung edema and diffuse hemorrhage were observed in rats after smoke inhalation, and the degree of lung injury in the treatment group was lower than that in the injury group. Lung W/D ratio in the injury group was increased significantly compared with the control group [(5.02±0.13) vs (4.71±0.13),P=0.003]. W/D ratio in the treatment group was decreased significantly compared with the injury group [(4.76±0.18) vs (5.02±0.13),P=0.012]. PAU in the injury group was increased significantly compared with the control group [(1.93±0.58) vs (1.33±0.17),P=0.027]. PAU and EF50 in the treatment group were decreased significantly compared with the injury group [(1.29±0.43) vs (1.93±0.58),P=0.027; (0.58±0.15) mL/sec vs (1.19±0.40) mL/sec,P=0.035].ConclusionThe treatment of 20AA compound amino acid injection plus high-dose vitamin B6can significantly improve the lung function and alleviate acute lung injury induced by smoke inhalation However, the mortality of rats is increased after smoke inhalation because of intolerance of the large dose of intraperitoneal injection of above liquids.

Airtight cabin; Smoke inhalation; Acute lung injury; Compound amino acid; Vitamin B6

10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2017.04.004

全軍部隊(duì)衛(wèi)生和疾病防控應(yīng)用性研究指令性課題(13BJYZ28)

400038 重慶,第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所1;233010 安徽 蚌埠,解放軍裝甲兵學(xué)院門診部2;100101 北京,解放軍第三○六醫(yī)院特種醫(yī)學(xué)中心3

曹佳,Email:caojia1962@126.com

2017-07-29)

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孫磊,蔡穎,敖琳,等.20AA復(fù)方氨基酸聯(lián)用大劑量維生素B6對(duì)密閉艙室煙霧吸入性肺損傷救治效果研究[J/CD].中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志,2017,3(4):212-217.