一種經(jīng)肝門(mén)靜脈注射制備腸源性膿毒癥大鼠模型的方法

王守軍 康新 路曉光 楊軼侖 范治偉 白黎智 宋軼

·論著·

一種經(jīng)肝門(mén)靜脈注射制備腸源性膿毒癥大鼠模型的方法

王守軍1,2康新1路曉光1楊軼侖1范治偉1白黎智1宋軼1

目的建立一種經(jīng)肝門(mén)靜脈注射制備腸源性膿毒癥(GOS)大鼠模型。方法清潔級(jí)SD大鼠84只(250～300 g,12周齡),12只大鼠用于盲腸結(jié)扎并穿孔法(CLP)制備腸源性腹腔滲出液。72只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為肝門(mén)靜脈對(duì)照組(PV-S組)、肝門(mén)靜脈滲液組(PV-E組)和下腔靜脈滲液組(VC-E組),每組24只。PV-S組經(jīng)肝門(mén)靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(1 mL/只),PV-E組和VC-E組分別經(jīng)肝門(mén)靜脈和下腔靜脈注射等量腹腔滲出液。各組大鼠再按腹腔滲液注射后1,2,4,6 h分為4個(gè)亞組。各亞組大鼠在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,處死后取肺組織并收集肺泡灌洗液(BALF),測(cè)定血清和BALF中內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量,計(jì)算肺組織濕/干重(W/D)比值,觀察肺形態(tài)學(xué)和病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果PV-E組在腹腔滲液注射液后1,2,4,6 h血清和BALF中內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量以及肺組織病理學(xué)評(píng)分、肺濕/干重比均顯著高于同時(shí)相點(diǎn)PV-S組大鼠(P均<0.05)。與PV-E組比較,VC-E組在腹腔滲液注射液后1，2，4，6 h血清和BALF中內(nèi)毒素水平均升高(P均<0.05),而血清和BALF中TNF-α、IL-6水平降低(P均<0.05)。PV-E組大鼠經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液后1，2，4，6 h肺組織W/D值(1 h:8.53±2.05；2 h:9.41±1.24；4 h:10.35±0.69；6 h:11.05±1.95)較同時(shí)相點(diǎn)的PV-S組(1 h:5.16±1.13；2 h:5.17±1.34；4 h:5.14±2.04；6 h:5.13±1.95)和VC-E組(1 h:6.71±0.73；2 h:7.65±1.32；4 h:8.40±0.43；6 h:9.41±1.87)均明顯增大(P均<0.05)。與PV-S組比較,PV-E組肺組織明顯腫脹,有廣泛點(diǎn)、片狀出血點(diǎn)及淤血；VC-E組肺組織病變程度較PV-E組輕。與PV-S組和VC-E組比較,PV-E組肺病理組織學(xué)結(jié)果顯示肺泡腔中見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁破壞嚴(yán)重、肺間質(zhì)明顯水腫,各時(shí)相點(diǎn)病理學(xué)組織學(xué)評(píng)分高于PV-S組(1 h:5.32±1.35 vs 0.25±0.02；2 h:6.44±0.72 vs 0.23±0.04；4 h:7.52±1.45 vs 0.27±0.02；6 h:8.69±0.35 vs 0.22±0.05，P均<0.05)和VC-E組(1 h:5.32±1.35 vs 3.37±0.73；2 h:6.44±0.72 vs 4.82±1.32；4 h:7.52±1.45 vs 6.47±0.43；6 h:8.69±0.35 vs 8.4±1.87，P均<0.05)。結(jié)論采用CLP 方法制備腹腔滲出液,經(jīng)肝門(mén)靜脈注射后可成功建立肺損傷為突出表現(xiàn)的GOS大鼠模型。

腸源性膿毒癥； 盲腸結(jié)扎并穿孔法； 肝門(mén)靜脈注射； 內(nèi)毒素； 腫瘤壞死因子-α；白介素-6

腸源性膿毒癥(gut origin sepsis,GOS)是危重患者的常見(jiàn)并發(fā)癥,可繼發(fā)急性肺損傷(acute lung injury,ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),已成為危重患者的重要死因之一。與其他部位感染所致的膿毒癥相比,GOS的感染灶更為隱匿、臨床檢查手段有限,故而病死率居高不下[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)[2-4],重癥急性胰腺炎、失血性休克大鼠均存在腸黏膜屏障功能障礙。大量腸內(nèi)細(xì)菌與毒素滲出至腹腔產(chǎn)生的腹腔滲出液中,存在大量毒性物質(zhì),如大腸桿菌等致病菌及其代謝產(chǎn)物、細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎性介質(zhì)。這些腸源性細(xì)菌和內(nèi)毒素易位入血是引發(fā)膿毒癥、ALI/ARDS及MODS的重要原因[5-7]。但由于目前尚無(wú)符合相應(yīng)臨床表現(xiàn)的動(dòng)物模型制備方法,因此極大限制了GOS相關(guān)基礎(chǔ)研究的進(jìn)行。為此,筆者設(shè)計(jì)了一種經(jīng)肝門(mén)靜脈注射由盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and perforation,CLP)制備的腸源性腹腔滲出液的方法,模擬GOS早期細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)肝門(mén)靜脈入血致ALI的病程發(fā)展過(guò)程，為進(jìn)一步進(jìn)行GOS相關(guān)基礎(chǔ)研究提供一種新的建模方法。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和設(shè)備

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)成年SD大鼠84只,雌雄不限,體重250～300 g,由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):SCXKGGD:2014-0025)。 本實(shí)驗(yàn)獲得大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物處置過(guò)程符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

(二)主要試劑和設(shè)備

戊巴比妥鈉(上海伊卡生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):EK140512)；大鼠TNF-α及IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定試劑盒(美國(guó)Biosource)；LEGEND MICRO 21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司)；大鼠革蘭陰性菌脂多糖檢測(cè)試劑盒(天津一瑞生物工程有限公司) 和MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(北京金山川科技發(fā)展有限公司)。

二、動(dòng)物分組與模型制備

(一)動(dòng)物分組

隨機(jī)數(shù)字法選取12只SD大鼠,用以制備GOS腹腔滲出液。余72只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組:肝門(mén)靜脈對(duì)照組(PV-S組)、肝門(mén)靜脈滲液組(PV-E組)和腔靜脈滲液組(VC-E組),每組24只。每組再按腹腔滲出液注射后1，2，4 ，6 h分為四個(gè)亞組。

(二)模型制備

1. CLP法[8]制備并采集腹腔滲出液:(1)12只SD大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,術(shù)前禁食12 h,禁水4 h。(2)經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(劑量為1 mL/kg體重)麻醉,取仰臥位,腹部術(shù)區(qū)備皮,碘伏消毒皮膚,鋪無(wú)菌手術(shù)洞巾。(3)作長(zhǎng)度約2.0 cm的上腹部正中切口,逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織,打開(kāi)腹膜,進(jìn)入腹腔。(4)牽盲腸于腹腔外,在距盲腸根部0.5 cm處結(jié)扎,用18號(hào)針頭于對(duì)腸系膜緣盲腸壁透刺2個(gè)間距約1 cm的孔,將結(jié)扎后的盲腸還納入腹腔。(5)為防止盲腸結(jié)扎穿孔后局部網(wǎng)膜組織包裹,炎癥局限,腹腔無(wú)腹水出現(xiàn),關(guān)腹前腹腔內(nèi)注入0.9%氯化鈉注射液3 mL,逐層縫合腹膜、肌肉及皮膚。(6)術(shù)后置SD大鼠于溫暖、潔凈鼠籠內(nèi)。(7)造模后6 h,無(wú)菌條件下穿刺腹腔采集腹腔滲出液。每只大鼠可采集5～10 mL的腹腔滲出液,12只大鼠共收集了96 mL腹腔滲出液。將收集的腹腔滲出液注入250 mL無(wú)菌輸液瓶中,連接一次性使用精密過(guò)濾輸液器(過(guò)濾介質(zhì)孔徑為5 μm),過(guò)濾去除直徑>5 μm的顆粒狀物,收集濾出液備用(-20℃冰箱保存)。

2. 制備GOS模型:PV-S組經(jīng)肝門(mén)靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(1 mL/只),PV-E組和VC-E組分別經(jīng)肝門(mén)靜脈和下腔靜脈注射等量CLP法制備的腹腔滲出液。(1)經(jīng)肝門(mén)靜脈注射法(圖1a)麻醉滿意后,取仰臥位,腹部術(shù)區(qū)備皮、消毒,鋪無(wú)菌手術(shù)洞巾。作上腹部正中2.0 cm長(zhǎng)的切口,逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織,打開(kāi)腹膜,進(jìn)入腹腔。用棉簽掀起肝葉,暴露第一肝門(mén)部位,顯露肝門(mén)靜脈。在肝門(mén)靜脈下1/3段,用1 mL一次性無(wú)菌注射器,將針體折曲15°,針頭斜面向上,呈曲棍球桿頭“L”形,進(jìn)針深度約1.0 cm；穿刺成功后PV-E組、PV-S組分別注射收集的腹腔滲出液和0.9%氯化鈉注射液(1 mL/只),持續(xù)時(shí)間1 min；注射完畢后退出針頭,迅速用無(wú)菌棉簽壓迫針眼,壓力大小以不出血且不阻斷肝門(mén)靜脈血流為宜,時(shí)間約5 min。觀察確定無(wú)活動(dòng)性出血后,關(guān)腹術(shù)終。(2)經(jīng)下腔靜脈注射法(圖1b):VC-E組穿刺部位選取肝門(mén)靜脈內(nèi)后方的肝下下腔靜脈,術(shù)前準(zhǔn)備、手術(shù)步驟與劑量同肝門(mén)靜脈注射法。

三、檢測(cè)指標(biāo)和方法

(一)血清內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量測(cè)定

1. 3組大鼠分別于肝門(mén)靜脈、下腔靜脈注射腹腔滲出液后1,2,4,6 h經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,低溫離心10 min(4℃,3 000 rpm)后取上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 動(dòng)態(tài)比濁法測(cè)定血清內(nèi)毒素變化:用于測(cè)定血清內(nèi)毒素的血樣采用含有少許肝素鈉的無(wú)熱原一次性采血管采集,3 000 rpm離心60 s分離得富血小板血漿,-30℃保存待用。檢測(cè)時(shí)取富血小板血漿0.05 mL,加入0.45 mL樣品處理液中,混勻后T01智能恒溫儀上70℃保溫10 min,取出后立刻放

注:GOS為腸源性膿毒癥。a:經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液；b:經(jīng)下腔靜脈注射腹腔滲出液

圖1經(jīng)肝門(mén)靜脈和下腔靜脈注射腹腔滲出液制備GOS大鼠模型

入冰水浴中,即為待測(cè)血漿樣品。取待測(cè)血漿0.2 mL直接加入反應(yīng)主劑中,溶解后使用微量加樣器轉(zhuǎn)移至10×75 mm標(biāo)準(zhǔn)玻璃反應(yīng)管中(不要產(chǎn)生氣泡),插入MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)測(cè)定系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后由標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血漿中內(nèi)毒素含量。操作中注意避免微生物及細(xì)菌污染。

3. ELISA法檢測(cè)血清TNF-α及IL-6含量變化:測(cè)定時(shí),取-20℃凍存待檢的血清復(fù)溫30 min,具體操作步驟按照ELISA法檢測(cè)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(二)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量測(cè)定

1.BALF采集與保存:動(dòng)物處死后,取各組大鼠的左側(cè)肺收集BALF。剪取5.0 cm長(zhǎng)無(wú)菌輸液器輸液管(D=1.8 mm)作為氣管插管,插入大鼠左側(cè)主支氣管內(nèi),并用4-0絲線結(jié)扎固定。5 mL注射器吸取預(yù)熱至37℃的0.9%氯化鈉注射液2.5 mL,經(jīng)輸液管-左支氣管緩慢低壓注入左肺,注入過(guò)程中可見(jiàn)肺組織充水后體積變大、顏色變蒼白；再用注射器將肺內(nèi)液體緩慢回吸,再次緩緩回注,如此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行5～10次,完成第1次灌洗過(guò)程。將回吸所得液體,注入離心管中,置于4℃冰浴保存；如此重復(fù)上述操作步驟,共3次,完成BALF的采集。將所收集的液體注入離心管中,離心(4℃,3 000 rpm,5 min)后取上清液置-20℃冰箱保存。

2.動(dòng)態(tài)比濁法測(cè)定BALF內(nèi)毒素含量,ELISA法檢測(cè)TNF-α及IL-6含量變化(方法同血清樣本的檢測(cè))。

(三)肺的大體形態(tài)學(xué)改變

大鼠采血后脫頸處死,取氣管及支氣管在內(nèi)的雙側(cè)肺組織,觀察其大體形態(tài)學(xué)改變。

(四)肺組織病理學(xué)改變

動(dòng)物處死后,取各組大鼠的右肺中上葉,稱重并計(jì)算濕/干重比值(wet and dry weight ratio,W/D)。取右肺下葉,經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片(厚度4 μm),蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色,光鏡下(×200)觀察肺組織病理學(xué)改變,并進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分(表1)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 肺病理組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

注: PMN為多形核白細(xì)胞,M為單核細(xì)胞

結(jié) 果

一、各組大鼠血清內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量比較

PV-E組大鼠在經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液后1,2,4,6 h的血清內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量均高于同時(shí)相點(diǎn)的PV-S組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；VC-E組大鼠的血清TNF-α及IL-6含量均低于同時(shí)相點(diǎn)的PV-E組,而血清內(nèi)毒素含量高于同時(shí)相點(diǎn)的PV-E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

二、各組大鼠BALF中內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量比較

PV-E組大鼠經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液后1,2,4,6 h,BALF中內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量較相同時(shí)相點(diǎn)的PV-S組均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；VC-E組大鼠腹腔滲出液注射后各時(shí)相點(diǎn)的BALF中,內(nèi)毒素含量高于相同時(shí)相點(diǎn)的PV-E組,而TNF-α及IL-6則低于同時(shí)相點(diǎn)的PV-E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

三、肺組織W/D值變化

PV-E組大鼠經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液后1，2，4，6 h肺組織W/D值較同時(shí)相點(diǎn)的PV-S組明顯增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。VC-E組大鼠肺組織W/D值在建模后均低于PV-E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表2 PV-S組、PV-E組、VC-E組大鼠建模不同時(shí)相點(diǎn)血清內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量比較

注:PV-S組為肝門(mén)靜脈對(duì)照組,PV-E組為肝門(mén)靜脈滲液組,VC-E組為下腔靜脈滲液組。GOS為腸源性膿毒癥,TNF-α為腫瘤壞死因子-α,IL-6為白細(xì)胞介素-6。與同時(shí)相點(diǎn)PV-S組比較：aP<0.05；與同時(shí)相點(diǎn)PV-E組比較：bP<0.05

表3 PV-S組、PV-E組、VC-E組大鼠建模不同時(shí)間點(diǎn)BALF中內(nèi)毒素、TNF-α及IL-6含量變化

注:PV-S組為肝門(mén)靜脈對(duì)照組,PV-E組為肝門(mén)靜脈滲組,VC-E組為下腔靜脈滲液組。BALF為肺泡灌洗液,GOS為腸源性膿毒癥,TNF-α為腫瘤壞死因子-α,IL-6為白細(xì)胞介素-6。與同時(shí)相點(diǎn)PV-S組比較：aP<0.05；與同時(shí)相點(diǎn)PV-E組比較：bP<0.05

表4 PV-S組、PV-E組、VC-E組大鼠建模不同時(shí)相點(diǎn)肺組織濕/干重比

注:PV-S組為肝門(mén)靜脈組,PV-E組為肝門(mén)靜脈滲液組,VC-E組為下腔靜脈滲液組。GOS為腸源性膿毒癥。與同時(shí)相點(diǎn)與PV-S組比較：aP<0.05；與同時(shí)相點(diǎn)PV-E組比較：bP<0.05

四、肺組織形態(tài)學(xué)比較

(一)解剖結(jié)構(gòu)比較

PV-S組未見(jiàn)明顯水腫及淤血。PV-E組大鼠的肺組織呈暗紅色,雙肺體積明顯增大、膨隆,廣泛點(diǎn)、片狀出血點(diǎn)及淤血,肺實(shí)變樣改變；擠捏肺組織,氣管內(nèi)可見(jiàn)紅色泡沫樣液體,切開(kāi)肺組織可見(jiàn)血性液體流出。VC-E組大鼠的肺組織表面出現(xiàn)出血點(diǎn)和腫脹,但肺損傷程度均較PV-E組輕。PV-E、VC-E組大鼠4個(gè)時(shí)相點(diǎn)的肺組織損傷程度隨時(shí)間呈漸進(jìn)性加重,但PV-E組大鼠損傷出現(xiàn)時(shí)間更早,程度更重。見(jiàn)圖2。

(二)病理組織學(xué)變化

1. 肺組織石蠟切片HE染色結(jié)果:PV-S組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整,肺泡間隙無(wú)水腫,肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)滲出及紅細(xì)胞。VC-E 組肺泡結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重,部分肺泡壁斷裂；肺間質(zhì)增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹；肺泡腔內(nèi)見(jiàn)較多滲出及紅細(xì)胞。PV-E 組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,肺間質(zhì)明顯增厚,血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹；肺泡腔內(nèi)、細(xì)支氣管壁及支氣管細(xì)動(dòng)脈周圍均可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主,并有大量滲出液和紅細(xì)胞出現(xiàn)。見(jiàn)圖3。

2.肺組織病理學(xué)評(píng)分:PV-E組大鼠在注射腹腔滲出液后1，2，4，6 h的肺組織病理學(xué)評(píng)分較同時(shí)相點(diǎn)的PV-S組增高(P均<0.05)。與PV-E組比較,VC-E組大鼠各時(shí)相點(diǎn)的肺組織病理學(xué)評(píng)分有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表5。

注:GOS為腸源性膿毒癥。a、b、c分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模1 h；d、e、f分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模2 h；g、h、i分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模4 h；j、k、l分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模6 h。注：PV-S組為肝門(mén)靜脈對(duì)照組,PV-E組為肝門(mén)靜脈滲液組,VC-E組為下腔靜脈滲液組

圖2各組大鼠建模后不同時(shí)相點(diǎn)肺組織形態(tài)學(xué)比較

注:GOS為腸源性膿毒癥。a、b、c分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模1 h；d、e、f分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模2 h；g、h、i分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模4 h；j、k、l分別為PV-S組、VC-E組和PV-E組建模6 h。注：PV-S組經(jīng)肝門(mén)靜脈對(duì)照組,PV-E組為肝門(mén)靜脈滲液組,VC-E組為經(jīng)腔靜脈滲液組

圖3 各組大鼠建模后不同時(shí)相點(diǎn)肺組織病理學(xué)比較(石蠟切片,HE染色,×200)

注:PV-S組經(jīng)肝門(mén)對(duì)照組,PV-E組為肝門(mén)靜脈滲液組,VC-E組為下腔靜脈滲液組。GOS為腸源性膿毒癥。與同時(shí)間點(diǎn)與PV-S組比較：aP<0.05；與PV-E組比較：bP<0.05

討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克和感染等病理因素可使腸黏膜屏障功能被破壞,腸道內(nèi)易位的細(xì)菌和內(nèi)毒素作用經(jīng)由肝、肺等組織“逐級(jí)放大”,引起全身炎癥反應(yīng)失控,最終導(dǎo)致MODS(其中以繼發(fā)性ALI、ARDS最為常見(jiàn)[1,9])。因此,GOS對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克和感染等疾病的轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。目前亟需建立一種符合臨床特征、凸顯肝肺作為“放大器”作用的GOS建模。本研究采用CLP法制備腸源性腹腔滲出液,以其中存在的大量細(xì)菌和毒性物質(zhì)作為媒介,建立一種GOS大鼠模型。

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中以脂多糖(LPS)為主的成分,肝臟作為清除內(nèi)毒素的主要臟器,也是遭受內(nèi)毒素攻擊的首要部位。正常情況下腸道中的少量?jī)?nèi)毒素被腸道吸收,經(jīng)肝門(mén)靜脈入肝臟后迅速被枯否氏細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)清除。本研究中,經(jīng)肝門(mén)靜脈注射GOS腹腔滲出液的PV-E組大鼠血清和BALF中內(nèi)毒素水平均低于經(jīng)下腔靜脈注射滲出液的VC-E組。證明了肝臟對(duì)內(nèi)毒素的吞噬作用。若過(guò)量的內(nèi)毒素入血,超過(guò)了肝臟的解毒能力,則可進(jìn)展為內(nèi)毒素血癥；血中內(nèi)毒素水平升高又可加重腸黏膜屏障功能損害,形成惡性循環(huán)[10]。

內(nèi)毒素為促炎介質(zhì)產(chǎn)生的啟動(dòng)因素[11-12]。Kupffer細(xì)胞被其激活后可釋放多種生物活性物質(zhì),包括細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6等)、趨化因子、過(guò)氧化物、一氧化氮(NO)、溶酶體酶和蛋白水解酶等,其中TNF-α是最重要的促炎介質(zhì)。TNF-α是內(nèi)毒素刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)后最早釋放的炎性細(xì)胞因子,可加重內(nèi)毒素的細(xì)胞毒性作用,導(dǎo)致機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的敏感性增強(qiáng)。同時(shí)TNF-α還可直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,并動(dòng)員、趨化、黏附、聚集、激活多形核中性白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN),使肺內(nèi)的PMN急劇增多并增強(qiáng)其吞噬能力,促進(jìn)PMN脫顆粒和溶酶體酶釋放,甚至致呼吸暴發(fā),產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基,破壞肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞。此外,內(nèi)毒素還可激活核因子-κB,介導(dǎo)其他細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8)的合成與釋放,啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步放大炎癥效應(yīng),造成肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,肺屏障功能遭到破壞而導(dǎo)致彌漫性肺水腫等肺部損傷[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液后,PV-E組大鼠的血清、BALF中TNF-α、IL-6和肺病理組織學(xué)評(píng)分顯著高于經(jīng)由下腔靜脈注射的VC-E組,提示經(jīng)肝門(mén)靜脈注射腹腔滲出液后全身(肺部)炎癥反應(yīng)被增強(qiáng),肝臟對(duì)GOS所致的全身炎癥反應(yīng)起到“放大效應(yīng)”的作用。分析其原因,可能是由于肝臟內(nèi)存在多種細(xì)胞可參與炎癥反應(yīng),其中最主要的是Kupffer細(xì)胞。雖然Kupffer細(xì)胞的數(shù)量?jī)H占全身吞噬細(xì)胞總量70%,但其吞噬能力占比高達(dá)95%,即促發(fā)全身炎癥反應(yīng)的潛在能力相當(dāng)巨大。腹腔滲出液中各種炎癥介質(zhì)、毒性物質(zhì)經(jīng)肝門(mén)靜脈到達(dá)肝臟后,作用于肝臟內(nèi)Kupffer細(xì)胞,活化肝內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)生成大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6等)；產(chǎn)生的TNF-α可經(jīng)血液循環(huán)播散至遠(yuǎn)隔組織器官,進(jìn)而導(dǎo)致ALI甚至ARDS的發(fā)生。

本研究經(jīng)肝門(mén)靜脈注射采用CLP法制備的腹腔滲出液,并以不同靜脈途徑(下腔靜脈)注射建模和同靜脈途徑0.9%氯化鈉注射液注射作為對(duì)照,觀察分析模型大鼠血清和BALF中內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)變化和肺組織形態(tài)、病理組織學(xué)改變,反映出了肝臟對(duì)GOS所致肺損傷的放大效應(yīng)。此建模方法將有利于研究GOS時(shí)肝、肺組織及其單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(Kupffer細(xì)胞與肺泡巨噬細(xì)胞)的病理及功能變化,了解GOS后肝、肺功能的損傷及其相互間作用的關(guān)系,探究調(diào)控細(xì)菌及內(nèi)毒素入肝過(guò)程和Kupffer細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥瀑布反應(yīng)機(jī)理等,為闡明GOS病理生理機(jī)制提供新思路、新方法。

1 王正國(guó),梁華平.戰(zhàn)創(chuàng)傷感染與膿毒癥防治新策略[J/CD].中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志,2015,1(1):1-2.

2 Lu XG,Kang X,Zhou FQ,et al. Effects of pyruvate-enriched peritoneal dialysis solution on intestinal barrier in peritoneal resuscitation from hemorrhagic shock in rats[J].J Surg Res,2015,193(1):368-376.

3 Xiaoguang Lu,Xin Kang,Libin Zhan,et al.Dai Huang Fu Zi Tang could ameliorate intestinal injury in a rat model of hemorrhagic shock by regulating intestinal blood flow and intestinal expression of p-VASP and ZO-1[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2014,14(1):80.

4 劉大全,李東華,劉洪斌,等.膿毒癥大鼠腸道及腹水中菌群變化研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(5):812-817．

5 Fragoso IT,Ribeiro EL,Gomes FO,et al.Diethylcarbamazine attenuates LPS-induced acute lung injury in mice by apoptosis of inflammatory cells[J].Pharmacol Rep,2017,69(1):81-89.

6 Szabo G,Romics L Jr,Frendl G.Liver in sepsis and systemic inflammatory response syndrome[J].Clin Liver Dis,2002,6(4):1045-1066.

7 Milani Júnior R,Pereira PM,Dolhnikoff M,et al.Respiratory mechanics and lung morphometry in severe pancreatitis-associated acute lung injury in rats[J].Crit Care Med,2009,23(10):1882-1889.

8 Wichterman KA,Baue AE,Chaudry IH.Sepsis and septic shock: a review of laboratory models and proposal[J].J Surg Res,1980,29(2):189-201.

9 馬曉媛,田李星,梁華平.中西醫(yī)結(jié)合診治膿毒癥的現(xiàn)狀及思考[J/CD].中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志,2015,1(1):13-17.

10 王春妍,范玉強(qiáng),胡東勝,等.大承氣湯對(duì)急性肝損傷大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥的干預(yù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(9):2325-2326.

11 Jang AS,Lee JU,Choi IS,et al.Expression of nitric oxide synthase, aquaporin 1 and aquaporin 5 in rat after bleomycin inhalation[J].Intensive Care Med,2004,30(3):489-495.

12 王飛.PD-1對(duì)膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞功能的影響與機(jī)制研究

[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2013.

13 Huang X,Tang J,Cai H,et al.Anti-Inflammatory Effects of monoammonium glycyrrhizinate on lipopolysaccharide-induced Acute lung injury in mice through regulating nuclear factor-kappa B Signaling Pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015:272474.

14 Chi X,Wei X,Gao W,et al.Dexmedetomidine ameliorates acute lung injury following orthotopic autologous liver transplantation in rats probably by inhibiting Toll-like receptor 4-nuclear factor kappa B signaling[J].J Transl Med,2015,13(1):190.

Amethodforpreparingratmodelofgutoriginsepsisviahepaticportalveininjection

WangShoujun1,2,KangXin1,LuXiaoguang1,YangYilun1,FanZhiwei1,BaiLizhi1,SongYi1.1

DepartmentofEmergencyMedicine,ZhongshanHospital,DalianUniversity,Dalian116001,China;2DepartmentofCareMedicine,CentralHospitalofWafangdianCity,Wafangdian116300,China

LuXiaoguang,Email:dllxg@126.com

ObjectiveTo establish a rat model of gut origin sepsis induced by portal vein injection.MethodsTwelve rats of 84 SD rats (250～300 g, 12 weeks) were used for preparation of peritoneal exudate of gut derived sepsis by cecal ligation and perforation (CLP). The other 72 rats were randomly divided into portal vein sham group (PV-S), portal vein exudate group (PV-E) and vena cava exudate group (VC-E), 24 rats in each group. Normal saline for 1 ml was injected into hepatic portal vein in PV-S group rats. The same amount of peritoneal exudate of gut origin sepsis was injected into rat body in PV-E group and VC-E group through the hepatic portal vein and inferior vena cava. Each group was divided into four subgroups according to intraperitoneal injection at 1, 2, 4 and 6 h. The abdominal aorta blood of subgroup was collected on different time points. The rats were executed and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected to detect the volume of endotoxin, tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum and BALF, calculate the wet/dry weight ratio (W/D) and observe morphological and pathological changes of the lung.ResultsConcentrations of endotoxin, TNF-α,and IL-6 and lung pathology score and lung W/D of PV-E group rat were significantly higher than those of PV-S groupafter peritoneal exudate injection 1,2,4,6 h (P<0.05). Compared to PV-E group, the levels of endotoxin in VC-E group rats were increased and TNF-αand IL-6 in serum and BALF were decreased after peritoneal exudate injection 1, 2, 4, 6 h (P<0.05). Compared with PV-S group, the rats showed pulmonary edema, extensive and patchy hemorrhage and congestion in PV-E group. The W/D in PV-E group(1 h:8. 53±2.05, 2 h:9.41±1.24, 4 h:10.35±0.69, 6 h:11.05±1.95) was higher than that of PV-S group (1 h:5.16±1.13, 2 h:5.17±1.34, 4 h:5.14±2.04, 6 h:5.13±1.95) and VC-E group (1 h:6.71±0.73, 2 h:7.65±1.32, 4 h:8.40±0.43, 6 h:9.41±1.87,P<0.05). The degree of lung injury in group VC-E was lighter than that of PV-E group. Pulmonary histology showed a large number of neutrophils and monocytes, and even red blood cell infiltration, severe alveolar wall destruction and pulmonary interstitial edema in the PV-E group rats, and the histological score in PV-E group was higher than that in PV-S group (1 h:5.32±1.35 vs 0.25±0.02. 2 h:6.44±0.72 vs 0.23±0.04. 4 h:7.52±1.45 vs 0.27±0.02. 6 h:8.69±0.35 vs 0.22±0.05,P<0.05) and VC-E group (1 h:5.32±1.35 vs 3.37±0.73. 2 h:6.44±0.72 vs 4.82±1.32. 4 h:7.52±1.45 vs 6.47±0.43.6 h:8.69±0.35 vs 8.4±1.87,P<0.05).ConclusionsThe CLP method can be used to prepare the intestinal derived peritoneal effusion. A rat model of intestinal origin sepsis is successfully established by the portal vein injecting intestinal derived peritoneal effusion.

Gut origin sepsis; Cecal ligation and perforation; Portal vein injection; Lipopolysaccharide; Tumor necrosis factor-α; Interleukin-6

丁茂乾,姚元章,屈紀(jì)富,等.咪達(dá)唑侖聯(lián)合瑞芬太尼治療破傷風(fēng)患者痙攣的療效[J/CD].中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志,2017,3(1):44-47.

10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2017.01.006

國(guó)家自然科學(xué)基金(81673801,81473512,81202831,81173397)

116001 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科1;116300 瓦房店市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科2

路曉光,Email:dllxg@126.com

2016-12-06)

(本文編輯:楚鷹)