鄂梨2號葉片高效再生體系的建立

涂俊凡+秦仲麒+李先明+伍濤+楊夫臣+朱紅艷+劉政+楊立

摘要：以早熟砂梨品種鄂梨2號組培苗葉片為外植體，建立葉片再生體系。結(jié)果表明，鄂梨2號葉片再生不定芽最佳培養(yǎng)基為NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA，愈傷組織再生率達(dá)到100%，不定芽再生率為36.67%；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，增殖系數(shù)為2.19；不定芽在1 000 mg/L ABT中浸蘸5 s后接種在添加500 mg/L活性炭的1/2MS培養(yǎng)基上，生根率最高，為66.67%；試管苗移栽成活率為84.44%。

關(guān)鍵詞：砂梨；鄂梨2號；組培苗葉片；再生

中圖分類號：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4613-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.049

Abstract： Leaves excised from Eli 2 Hao were used as explants to establish regeneration system. The results indicated that the maximum adventitious buds regeneration frequency achieved 36.67% on the mediu of NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA. The most suitable medium for shoot multiplication was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA and the average multiplication coefficient was 2.19. The buds were dipped in 1 000 mg/L ABT for 5 s and inoculated on 1/2MS medium with 500 mg/L activated carbon. The highest rooting rate was 66.67%， and the survival rate of plantlets was 84.44%.

Key words： sand pear； Eli 2 Hao； leaf； regeneration

鄂梨2號是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所選育的優(yōu)質(zhì)早熟砂梨新品種，果實7月中下旬成熟。果皮黃綠色，果實倒卵圓形，平均單果質(zhì)量200 g，含可溶性固形物12.0%～14.7%，總酸0.14%～0.16%[1]。本研究以早熟砂梨品種鄂梨2號試管苗葉片為試材，進行不定芽誘導(dǎo)與增殖以及生根等培養(yǎng)基的篩選，建立葉片高效再生體系，為鄂梨2號梨的規(guī)模化繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化改良及無性系變異篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為早熟砂梨品種鄂梨2號[Pyrus pyrifolia Nakai.cv.Eli 2 No.2]，組培苗來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所實驗室，葉齡30 d左右，外植體為長勢良好的葉片。

1.2 葉片不定芽誘導(dǎo)

取繼代培養(yǎng)4～5周、長勢較為一致的試管苗上部葉片，在無菌條件下，將葉片切割成大小為0.5～1.0 cm×0.5～1.0 cm的葉盤，每個處理接種20個外植體，重復(fù)3次，接種在附加TDZ和IBA的NN69、MS培養(yǎng)基上，30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、pH 5.8。暗培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照1 500 lx，光周期16 h/d。接種后60 d統(tǒng)計數(shù)據(jù)。不定芽誘導(dǎo)率=萌芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.3 不定芽的增殖

將葉片上誘導(dǎo)的不定芽接種在不同處理的MS增殖培養(yǎng)基上。①細(xì)胞分裂素對鄂梨2號組培苗增殖的影響：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 6-BA共5個濃度梯度。②生長素對鄂梨2號組培苗增殖的影響：0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L NAA；0.05、0.10、0.20 mg/L IBA。20 d后統(tǒng)計不定芽。

1.4 組培苗生根與移栽

組培苗生根：切取長約2 cm生長健壯的不定芽，在不同培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。浸蘸生根法：組培苗基部在1 000 mg/L ABT溶液中浸泡5 s后，接種在不同培養(yǎng)基中。每處理30個外植體，重復(fù)3次，暗培養(yǎng)2周，30 d后統(tǒng)計生根率。

組培苗移栽：用23 cm×18 cm的營養(yǎng)缽做移栽容器，將根長0.5 cm以上的試管苗放在溫室中煉苗，加遮陽網(wǎng)閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗1 d后，洗凈根系，移栽入不同基質(zhì)的營養(yǎng)缽中。塑料拱棚保濕，上蓋遮陽網(wǎng)。每天適量澆水，30 d后統(tǒng)計移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對鄂梨2號葉片不定芽再生的影響

由表1可知，基本培養(yǎng)基的種類及激素濃度對鄂梨2號不定芽再生有顯著影響。處理A6不定芽分化率最高（36.67%），不定芽數(shù)量較多，莖、葉明顯，長勢好；處理A8出芽率次之，不定芽數(shù)量較多，長勢較好。鄂梨2號葉片接種后，暗培養(yǎng)7 d左右，葉片開始膨大（切口和葉脈處明顯膨大）；21 d左右出現(xiàn)芽點；30 d后，芽點發(fā)育成明顯小芽。鄂梨2號葉片接種在NN69+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上，21 d暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織再生率100%，不定芽再生率36.67%。

2.2 不定芽增殖

2.2.1 細(xì)胞分裂素對鄂梨2號組培苗增殖的影響 鄂梨2號葉片不定芽接種在添加0.1 mg/L IBA和不同濃度6-BA的MS培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，6-BA濃度為0.5～1.5 mg/L時，不定芽正常增殖，且隨著濃度增加，組培苗增殖系數(shù)增加。6-BA濃度大于2.0 mg/L時，組培苗易玻璃化（表2）。endprint

2.2.2 生長素對鄂梨2號組培苗增殖的影響 鄂梨2號葉片不定芽接種在添加1.0 mg/L 6-BA和不同濃度的NAA和IBA的MS培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，添加不同濃度的NAA和IBA對鄂梨2號組培苗生長勢有較大影響。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02～0.05 mg/L NAA，繼代的組培苗生長健壯，葉片淡綠，NAA濃度高于0.1 mg/L時，組培苗基部生成較多愈傷組織。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10～0.20 mg/L IBA，繼代的組培苗生長健壯，IBA濃度低，繼代的組培苗生長緩慢，濃度為0.30 mg/L時，組培苗細(xì)弱（表3）。

2.3 不同生根劑及處理方法對組培苗生根的影響

鄂梨2號組培苗在高濃度的生根劑中浸蘸的生根效果優(yōu)于添加低濃度生根劑的培養(yǎng)基。鄂梨2號組培苗在1 000 mg/L ABT中浸蘸5 s后接種在添加500 mg/L活性炭的1/2MS培養(yǎng)基上，生根率最高，為66.67%。組培苗在添加不同濃度生根劑的培養(yǎng)基上，生根率僅為8.33%～16.67%（表4）。

2.4 組培苗移栽

移栽基質(zhì)對組培苗移栽成活率有重要的影響。不同移栽基質(zhì)組培苗成活率差異很大，蛭石和珍珠巖（體積比2∶1）作為移栽基質(zhì)時成活率最高，為84.44%；蛭石和珍珠巖（體積比1∶1）作為移栽基質(zhì)效果次之，為61.11%，蛭石作為移栽基質(zhì)的生根率為45.56%；蛭石和草炭配比的基質(zhì)效果最差，為22.22%（表5），生根組培苗移栽第一周部分已腐爛。圖1為鄂梨2號葉片組織培養(yǎng)再生。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類包括MS、1/2MS、NN69、WPM等[2-10]，大量研究結(jié)果證明NN69比較適宜梨品種葉片再生[2-4]，與本試驗結(jié)果一致。以NN69為基本培養(yǎng)基，添加TDZ和IBA兩種生長調(diào)節(jié)劑，建立了鄂梨2號葉片離體直接再生體系，使鄂梨2號的組培苗工廠化生產(chǎn)成為可能。

細(xì)胞分裂素（6-BA等）與生長素（IBA等）配合使用，比例協(xié)調(diào)時可促進芽苗增殖及伸長生長[2，5]。本試驗在不定芽繼代增殖過程中，配比使用6-BA、NAA或IBA，促進了不定芽的增殖和伸長生長，組培苗增殖系數(shù)偏低，長勢較好。組培苗增殖過程中，繁殖系數(shù)過高，會引起組培苗弱化，生長勢變差。一般可通過降低細(xì)胞分裂素濃度降低高代次繁殖系數(shù)，而維持較高的平均繁殖系數(shù)和較好的試管苗長勢，有關(guān)問題需進一步研究。

本試驗通過組培苗在高濃度的生根劑中浸蘸后接種在不含植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，生根率達(dá)到66.67%，且生根時間較短。根原基的啟動和形成階段生長素起關(guān)鍵作用，而根原基的伸長和生長則可以在沒有外源生長素的條件下實現(xiàn)。生長素可能主要在根的誘導(dǎo)和發(fā)端起作用，但根原基形成后，較高濃度的生長素的繼續(xù)存在則不利于幼根的生長發(fā)育。本試驗成功建立了鄂梨2號葉片不定芽分化和植株再生體系，為鄂梨2號的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程育種打下了基礎(chǔ)。

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