固相萃取—高效液相色譜法測(cè)定烤煙中角鯊烯含量

董麗紅+韋建玉+胡亞杰+陳澤鵬+張功營(yíng)+萬(wàn)樹青

摘要：通過(guò)優(yōu)化提取劑、提取方法、凈化劑等前處理方法和色譜條件，建立了烤煙中角鯊烯含量測(cè)定的SPE-HPLC方法。烤煙樣品用三氯甲烷超聲提取40 min，硅膠柱凈化，高效液相色譜儀[檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相：甲醇/乙腈=75/25（V/V）]檢測(cè)，可以準(zhǔn)確地測(cè)定烤煙中角鯊烯含量；角鯊烯濃度在0.5～10 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9976）。方法的檢出限（S/N=3）為 0.12 mg/L，定量限（S/N=10）為 0.39 mg/L，平均加標(biāo)回收率為 88.12%。利用該方法對(duì)5個(gè)不同地區(qū)的同品種烤煙中角鯊烯含量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果表明，不同地區(qū)的烤煙中角鯊烯含量有所差異。該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可用于烤煙中角鯊烯的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：烤煙；角鯊烯；固相萃??；高效液相色譜儀

中圖分類號(hào)：S572文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）12-0130-05

Abstract A SPE-HPLC method to determinate squalene in flue-cured tobacco was established by optimizing the chromatographic conditions and pretreatment method （extractant， extraction method and purification agent）. After validation， the method was used to measure the squalene in flue-cured tobacco from five different areas. Flue-cured tobacco samples were extracted by trichloromethane for 40 minutes and purified with the silica gel column. And the squalene content in samples was detected by the high performance liquid chromatograph （detection wavelength： 210 nm； mobile phase： methanol/acetonitrile = 75/25（V/V））. The squalene concentration showed a good linear relationship in the range of 0.5～10 mg/L （r=0.9976）. The limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） of established method were 0.12 mg/L and 0.39 mg/L， respectively. The average recovery was 88.12% at three spiked levels. The results showed that the squalene content in flue-cured tobacco from different areas was different. The established SPE-HPLC method had high accuracy and good reproducibility， which could be used for the determination of squalene in flue-cured tobacco.

Keywords Flue-cured tobacco； Squalene；Solid phase extraction； High performance liquid chromatograph

角鯊烯是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，具有提高血紅蛋白的攜氧能力，促進(jìn)新陳代謝，提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗腫瘤等多種生理功能，是一種具有防病治病作用的生物活性物質(zhì)[1-3]。角鯊烯不僅存在動(dòng)物體內(nèi)，在植物中的分布也十分廣泛，橄欖油和棕櫚油中含有較豐富的角鯊烯，但其它植物中也有角鯊烯的存在，如鼠尾草、蕨類植物、綠色藻類植物、苔蘚植物及煙葉等[4-8]。

卷煙煙氣中含有多種有害化合物，其中自由基具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，性質(zhì)較活潑，可以參與人體的多種生化反應(yīng)，誘發(fā)多種疾病，對(duì)人體危害較大[9-14]。目前，清除卷煙煙氣自由基的主要方法是向煙絲和濾嘴中加入自由基清除劑，研究發(fā)現(xiàn)向卷煙中添加角鯊烯、番茄紅素、銀杏葉提取物、丁香酚、類胡蘿卜素等對(duì)卷煙煙氣中的自由基均有明顯的清除作用，其中角鯊烯對(duì)卷煙主流煙氣中自由基的清除率為35.4%～35.9%，但因技術(shù)或成本等原因真正應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)的較少[15-20]。因此，篩選和培育出含有角鯊烯的煙草品種對(duì)卷煙煙氣中自由基的降低具有重要意義。

目前，角鯊烯的檢測(cè)方法較多，如高效液相色譜法（HPLC）[21]、氣相色譜法（GC）[22，23]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）[24]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[25]，但應(yīng)用到烤煙中角鯊烯的檢測(cè)方法未見報(bào)道。因此，本研究擬建立烤煙中角鯊烯的固相萃取-高效液相色譜法，并利用該方法測(cè)定不同地區(qū)烤煙中角鯊烯的含量，以期為進(jìn)一步篩選和培育含角鯊烯的煙草品種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

烤煙（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供）；角鯊烯對(duì)照品（純度≥99.8%，中國(guó)藥檢所）；甲醇、乙腈（色譜級(jí)）；三氯甲烷、正己烷、石油醚、丙酮（分析級(jí)）；凈化劑：PSA凈化柱，硅膠凈化柱（Welchrom公司）；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜。endprint

高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器，Agilent1100，美國(guó)Agilent公司）；臺(tái)秤：T-10000型，d=0.1 g[美國(guó)雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司]；電子天平：BSA224S型，d=0.1 mg[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器：RE52-99型（上海亞榮生化儀器廠）；真空抽濾泵：SHZ-DⅢ型（河南省鞏義市予華儀器有限公司）；超聲波清洗器：KQ-500型（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋：501數(shù)顯型（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；粉粹機(jī)：750T（浙江省永康市鉑歐五金廠）；孔徑0.45 mm（40目）篩網(wǎng)。

1.2 烤煙樣品前處理方法

用粉碎機(jī)將烤煙樣品粉碎，過(guò)40目篩網(wǎng)。取試樣1.0 g 于50 mL具塞錐形瓶中，精確至0.1 g，向其中加入30 mL三氯甲烷，蓋上塞子，超聲提取40 min，抽濾，準(zhǔn)確移取提取液12 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用12 mL正己烷充分溶解，得正己烷提取液。用10 mL正己烷對(duì)固相硅膠凈化柱進(jìn)行預(yù)淋洗后，將正己烷提取液緩慢加入，用10 mL正己烷洗脫，將洗脫液一并收集并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL乙腈溶解，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，得樣液。如需存放，應(yīng)在4℃冰箱密封保存，并在3 d內(nèi)測(cè)定。

1.3 色譜分析條件

Agilent SB-C18色譜柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇/乙腈（V/V）=75/25， 流速為1.0 mL/min， 柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取0.10 g角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.01 g，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，充分振蕩溶解，配制成1 000 mg/L的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)母液。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液應(yīng)在4℃以下保存，于72 h內(nèi)使用。

1.4.2 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 準(zhǔn)確移取5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別準(zhǔn)確移取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容。該系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度依次為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 檢出限與定量限

分別稱取等質(zhì)量的烤煙樣品，向樣品中依次加入不同質(zhì)量濃度的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)工作液，以加入等質(zhì)量的乙腈為本底樣品對(duì)照組。按“1.2”的方法進(jìn)行處理，檢測(cè)后取信噪比 S/N = 3 對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方法檢出限（LOD），信噪比S/N =10 對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方法定量限（LOQ）。

1.6 回收率與精密度

分別稱取等質(zhì)量的烤煙樣品，向樣品中分別添加 3個(gè)濃度水平的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)液，以加入等質(zhì)量的乙腈為本底樣品對(duì)照組。按“1.2”的方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度連續(xù)重復(fù)5 次，計(jì)算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

角鯊烯為不飽和烴類，易溶于正己烷、石油醚、丙酮和三氯甲烷等有機(jī)溶劑中，試驗(yàn)中選擇這四種溶劑作為提取劑分別對(duì)烤煙樣品中角鯊烯進(jìn)行提取。結(jié)果（圖1）表明，以三氯甲烷為提取劑對(duì)烤煙樣品中角鯊烯提取率最高，這與李冬梅等[26]不同提取方法對(duì)茶油中角鯊烯的提取率研究結(jié)果有所差異，這可能是由于角鯊烯存在于不同的基質(zhì)中所造成的。

2.2 提取方法的選擇

關(guān)于角鯊烯的提取方法以索氏提取法和皂化提取法居多[27， 28]，但這兩種方法耗時(shí)較多、步驟復(fù)雜。為了探索簡(jiǎn)單、便捷的提取方法，本試驗(yàn)在以三氯甲烷為提取劑的基礎(chǔ)上，對(duì)烤煙中角鯊烯不同提取方法（超聲波輔助提取法、索氏提取法、皂化提取法、冷浸提取法）進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)超聲波輔助提取法中的超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果（圖2）表明，利用超聲波輔助提取法對(duì)烤煙樣品超聲提取40 min，提取率較其它三種提取方法高且用時(shí)較少，因此，試驗(yàn)中選擇超聲波輔助提取法（40 min）對(duì)烤煙中的角鯊烯進(jìn)行提取。

2.3 凈化劑的選擇

烤煙樣品中基質(zhì)較復(fù)雜，檢測(cè)樣品中角鯊烯時(shí)干擾因素較多，且利用分散固相萃取法、液液萃取法等凈化方法效果均不理想。在樣品前處理過(guò)程中，選擇利用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。試驗(yàn)中考察了硅膠與PSA（N-丙基乙二胺填料）兩種凈化柱凈化效果，結(jié)果（圖3、圖4）表明，利用硅膠凈化柱的凈化效果優(yōu)于PSA凈化柱，因此，試驗(yàn)中選擇利用硅膠凈化柱對(duì)烤煙樣品進(jìn)行凈化處理。

2.4 色譜柱的選擇

考察了不同類型的反相色譜柱對(duì)烤煙樣品的分離分析效果，并對(duì)高效液相的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇?？緹煒悠方?jīng)色譜柱Agilent HC-C8 （5 μm，4.6 mm×250 mm）檢測(cè)的出峰時(shí)間比Agilent SB-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm）提前17 min，但Agilent HC-C8對(duì)樣品檢測(cè)的重現(xiàn)性不好且干擾較多?？紤]到檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性等因素，試驗(yàn)中選用Agilent SB-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm）作為烤煙樣品的分離分析色譜柱。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

角鯊烯系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立角鯊烯的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，角鯊烯的線性回歸方程為y=53.013x+0.6452，相關(guān)系數(shù)r=0.9976。試驗(yàn)結(jié)果表明，角鯊烯濃度在0.5～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好；分別以儀器信噪比（S/N=3，S/N=10）所對(duì)應(yīng)的溶液濃度計(jì)算得出該方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.12、0.39 mg/L。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品和烤煙樣品（凈化后）的色譜圖分別見圖5、圖6。endprint

2.6 方法的精密度

按1.2方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，在1.3的色譜條件下對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析（平行試驗(yàn)，n=5），檢測(cè)方法的日內(nèi)與日間精密度（RSD）分別為3.12%、3.46%，結(jié)果（表1）表明，該檢測(cè)方法的精密度良好。

2.7 加標(biāo)試驗(yàn)

按1.2方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，在1.3的色譜條件下對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)（平行試驗(yàn)，n=5），計(jì)算得出烤煙樣品中角鯊烯的本底含量約為10.0 mg/kg。分別以烤煙樣品中角鯊烯本底值的1.5倍（高）、1.0倍（中）、0.5倍（低）進(jìn)行三個(gè)濃度水平添加，測(cè)定烤煙中角鯊烯的加標(biāo)回收率。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，烤煙中角鯊烯的平均加標(biāo)回收率為88.12%，該檢測(cè)方法回收率較好。

2.8 不同地區(qū)烤煙中角鯊烯含量測(cè)定

取5個(gè)地區(qū)的烤煙樣品，按1.2方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，在1.3的色譜條件下對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)（平行試驗(yàn)，n=5），試驗(yàn)結(jié)果（表3）中測(cè)得不同地區(qū)烤煙中角鯊烯含量在10.0～12.9 mg/kg，不同地區(qū)由于種植環(huán)境等因素不同，烤煙樣品中角鯊烯含量也有所差異。

3 結(jié)論

本研究對(duì)烤煙樣品的前處理方法和高效液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了烤煙中角鯊烯含量的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）檢測(cè)方法。該方法的線性范圍為0.5～10 mg/L，回收率為84.68%～92.29%，檢出限和定量限分別為0.12、0.39 mg/L。利用已確定的方法測(cè)定5個(gè)不同地區(qū)的同品種烤煙中角鯊烯含量范圍為10.0～12.9 mg/kg，這可能是由于種植環(huán)境不同所造成的。該方法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。

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