‘小白杏’誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽體系的優(yōu)化

謝曉婷+郭明星+許竹葉+代麗娟+郝風(fēng)順+馮建榮

摘要：為建立快速繁殖離體培養(yǎng)再生體系并為遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)，本研究以‘小白杏胚和葉片為材料，探討了氯化汞和次氯酸鈉消毒的方法和時間對種子和種胚的影響，2，4-D（0.5，1.0，1.5 mg/L）、ZT（0.5，1.0，1.5 mg/L）和TDZ（1.0，2.0，3.0 mg/L）濃度配比對‘小白杏胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化不定芽的作用，及2，4-D（0.5，1.0 mg/L）、IBA（0.5，1.0 mg/L）、NAA（0.5，1.0 mg/L）濃度配比對‘小白杏葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化不定芽的作用。結(jié)果表明：使用10%的次氯酸鈉消毒10 min，種胚污染率和死亡率最低，分別為2.6%、0.7%，存活率最高，為96.7%；在3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D處理下，胚誘導(dǎo)愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率最高，分別為98%、96%；在3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA處理下，葉片誘導(dǎo)愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率最高，分別為96%、93%。綜合來看，胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的誘導(dǎo)率優(yōu)于葉片，種子和種胚消毒的最佳方案是10%的次氯酸鈉消毒10 min；胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽最佳配方是3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D；葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的最佳配方是3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：杏；胚；葉片；愈傷組織；不定芽

中圖分類號：S662.2文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0006-05

Abstract To establish rapid propagation and regeneration system for ‘Xiaobaixing in vitro and provide foundations for genetic transformation， with embryo and leaf as explants， we studied the effects of disinfection with mercuric chloride and sodium hypochlorite on seed and embryo， the effects of different concentration ratios of 2，4-D（0.5，1.0，1.5 mg/L），ZT（0.5，1.0，1.5 mg/L）and TDZ （1.0，2.0，3.0 mg/L） on embryo induction， and that of 2，4-D（0.5，1.0 mg/L），IBA（0.5，1.0 mg/L）and NAA（0.5，1.0 mg/L）on leaf induction.The results showed that the pollution rate and mortality were the lowest with 10% sodium hypochlorite disinfecting seed and embryo for 10 minutes， which were 2.6% and 0.7% respectively， and the survival rate was the highest as 96.7%. In the treatment condition of 3/4MS containing with 2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L 2，4-D， the rate of callus formation and adventitious bud induction with embryo as explant were the highest， which were 98% and 96%， respectively. In the treatment condition of 3/4MS containing with 2.0 mg/L AgNO3， 1.0 mg/L ZT， 2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L IBA， the rate of callus formation and adventitious bud induction with leaf as explant were the highest， which were 96% and 93% respectively.In conclusion， the callus differentiation to adventitious buds with embryo as explant was better than that with leaf as explant. The best treatment for disinfecting seed and embryo was both with 10% sodium hypochlorite for 10 minutes. The optimal medium for inducing callus redifferentiation to adventitious buds of embryo was 3/4MS containing with 2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L 2，4-D， while that for leaves was 3/4MS containing with 2.0 mg/L AgNO3，1.0 mg/L ZT，2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L IBA.

Keywords Apricot；Embryo；Leaves；Callus；Adventitious budendprint

新疆是世界杏的起源中心之一，有著豐富的種質(zhì)資源[1-3]?！“仔赢a(chǎn)于享有“中國白杏之鄉(xiāng)”稱號的庫車縣和輪臺縣[4]，是當(dāng)?shù)孛耖g長期連續(xù)實生選擇獲得的地方優(yōu)良品種，肉質(zhì)細(xì)膩香甜，種子殼薄易碎，但不耐儲運，自花結(jié)實率低。

核果類果樹胚培養(yǎng)始于1933年Tukey[5]對櫻桃的胚培養(yǎng)，通過胚可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生苗，在桃、杏、棗等果樹上均已獲得成功[6]。何炎紅等[7]以山杏成熟胚為外植體，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽，建立再生植株，為山杏快速繁殖和種質(zhì)資源保護等提供參考依據(jù)。在以葉片作為外植體的研究中，邊俊榮[8]已篩選出山杏葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，并發(fā)現(xiàn)葉片正面向下接觸培養(yǎng)基的再生效果較好。楚宗麗[9]篩選出凱特杏幼胚子葉不定芽誘導(dǎo)的適宜配方，解決了早期胚珠離體培養(yǎng)困難的問題。劉小蕾[10]通過對山杏葉片的組織培養(yǎng)初步建立了山杏再生體系。郭生武[11]成功地從大扁杏葉片誘導(dǎo)出愈傷組織，但未實現(xiàn)從愈傷組織獲得完整植株。而關(guān)于新疆南疆‘小白杏胚誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽和葉片誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽方面的研究尚未見報道。本研究分別以‘小白杏胚和葉片為外植體，通過對愈傷組織形成率及不定芽誘導(dǎo)率的比較，篩選適宜外植體，以期為‘小白杏高頻率離體培養(yǎng)再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年6月25日，采集新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺國家果樹資源圃杏品種‘小白杏。將果實去肉，洗凈果核，取出杏仁進行試驗。

1.2 試驗方法

試驗于2015年7月—2016年12月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹實驗室進行。

1.2.1 種子和種胚消毒 采用本課題組預(yù)備試驗的方法，用自來水沖洗種子30 min，無菌水沖洗4次，75%的酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗5次，然后用0.1%HgCl2 7 min、10%NaClO 10 min分別對種子消毒，再用無菌水沖洗4次并浸泡24 h后取出種胚，用流水清洗30 min，再以70%酒精浸泡30 s后用無菌蒸餾水清洗2次[8]，再分別用0.1% HgCl2 7 min、0.1% HgCl2 10 min、10%NaClO 7 min、10% NaClO 10 min、20%NaClO 7 min、20% NaClO 10 min進行種胚消毒。具體試驗設(shè)計見表1。

將處理好的種胚分別接種到1/2MS基本培養(yǎng)基中，每個配方接種30個種胚，重復(fù)5次，置于人工氣候箱暗培養(yǎng)20 d（25℃），一個月后統(tǒng)計種胚的污染率、死亡率和存活率。種胚污染率=（污染的種胚數(shù)/接種的種胚總數(shù)）×100%；種胚死亡率=（褐化死亡但未污染的種胚數(shù)/接種的種胚總數(shù)）×100%；種胚存活率= 100%-種胚污染率-種胚死亡率[8]。

1.2.2 胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽 本試驗以3/4MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過對2，4-D、ZT、TDZ 3種激素進行不同濃度的配比來設(shè)計培養(yǎng)配方（表2）。每個配方接種30個種胚，重復(fù)5次。置于暗培養(yǎng)箱25℃ 培養(yǎng)20 d后，再進行光培養(yǎng)，溫度為25℃，光周期為16 h光照8 h黑暗，光照強度為3 000 lx。每隔7 d觀察1次，記錄胚恢復(fù)生長的時間。在培養(yǎng)20、40 d時統(tǒng)計愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率。愈傷組織形成率=（分化出愈傷組織的外植體數(shù)/存活的外植體總數(shù)）×100%；不定芽誘導(dǎo)率 =（分化出不定芽的外植體數(shù)/存活的外植體總數(shù)）×100%[8]。將獲得的不定芽轉(zhuǎn)入本課題組篩選出的最優(yōu)壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，利用幼苗葉片進行葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的試驗。

1.2.3 葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽 選取進行過壯苗的植株上的葉片，依據(jù)前人經(jīng)驗[12]先進行預(yù)試驗，然后在葉片的正面進行橫向劃傷，并將正面貼于培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基以3/4MS為基本培養(yǎng)基，附加2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ，通過添加不同濃度的IBA、NAA、2，4-D設(shè)計培養(yǎng)配方（表3）。每個配方接種30個葉片，重復(fù)5次。接種后置于暗培養(yǎng)箱（25℃）培養(yǎng)14 d后進行光培養(yǎng)，溫度為25℃，光周期為16 h光照和8 h黑暗，光照強度為3 000 lx。分別在培養(yǎng)14、30 d時統(tǒng)計愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

通過SPSS 19.0進行差異分析，顯著水平為P< 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對‘小白杏種胚初代培養(yǎng)的影響

由表4可知，種子用10%NaClO消毒10 min處理的存活率均高于種子用0.1%HgCl2 消毒7 min。

同一種子消毒方法下，用NaClO消毒種胚的存活率高于用HgCl2消毒的，且均以10%NaClO消毒10 min的存活率最高，其次為20%NaClO消毒7 min。

綜合考慮，種子和種胚均以10%NaClO消毒10 min的效果最佳，種胚存活率可達96.7%，顯著高于其他處理。

2.2 不同配方對胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的影響

將‘小白杏的胚接入培養(yǎng)基7 d后，X3處理的愈傷開始有萌動的跡象（圖1A）。在第14 d時X3處理的胚開始長出少量乳白色雪花狀的愈傷組織（圖1B）。隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織的生長量不斷增加。而未發(fā)育出愈傷組織的胚先是體積逐漸膨大，隨后開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，最終變干死亡（圖1）。

由表5可知，X3處理的愈傷組織形成率為98%，不定芽誘導(dǎo)率為96%，顯著高于其他處理（P< 0.05）。TDZ和2，4-D組合的愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率較高，綜上得出，胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的最優(yōu)配方為3/4MS+2.0 mg/L TDZ+ 1.0 mg/L 2，4-D。endprint

2.3 不同配方對葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的影響

接種10 d后Y4處理的傷口處最先開始形成乳白色的愈傷，在20 d左右，不定芽開始陸續(xù)出現(xiàn)（圖2B）。由表6可知，Y4和Y5愈傷分化的時間最短為10d，Y1愈傷分化的時間最長為15d。Y4的愈傷組織形成率為96%，不定芽誘導(dǎo)率為93%，顯著高于其他處理（P< 0.05）。2，4-D和IBA處理的愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率均隨著其質(zhì)量濃度的增加而升高，而NAA處理的則隨著其質(zhì)量濃度的增加而降低，表明較高質(zhì)量濃度的2，4-D和IBA對愈傷形成和不定芽分化具有一定的促進作用，而高質(zhì)量濃度的NAA則對其具有一定的抑制作用。綜上可知，葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的最優(yōu)配方為3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA。

3 討論

現(xiàn)有的大量關(guān)于杏再生體系建立的報道中，研究山杏居多，研究者選用的外植體大都為其子葉[13]、莖段[14]、莖尖[15，16]等，主要探討了不同外植體及培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織和不定芽再生的影響[17-21]。山杏胚愈傷組織誘導(dǎo)率最高的配方是0.5 mg/L 2，4- D+1.0 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)率為80.37%[8]；山杏葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率最高的配方是QL+2.0 mg/L TDZ+0.75 mg/L NAA，其誘導(dǎo)率分別為100%和11.1%[12]。本試驗中，對‘小白杏胚誘導(dǎo)愈傷組織采用3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D配方的誘導(dǎo)率最高，為98%；葉片愈傷組織采用3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA的配方誘導(dǎo)率最高，為96%。可見，TDZ與2，4-D組合對‘小白杏胚誘導(dǎo)愈傷組織的效果優(yōu)于6-BA與2，4-D組合且TDZ濃度對種胚誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽影響較大，TDZ濃度為2.0 mg/L 時對愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)效果最好，這可能與TDZ可以促進植物芽的再生和繁殖、打破芽的休眠、促進種子萌發(fā)、促進愈傷組織生長等生理活性有關(guān)[22]。本試驗中尚未進行對根系的誘導(dǎo)研究以獲得完整植株，在今后的試驗中可進一步完善該環(huán)節(jié)。

4 結(jié)論

4.1 對‘小白杏種子和種胚進行消毒的最佳方案均為10%NaClO消毒10 min，存活率最高，為96.7%。

4.2 ‘小白杏胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的最佳配方為3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D，愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率分別為98%、96%。

4.3 ‘小白杏葉片誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽的最佳配方為3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA，愈傷組織形成率和不定芽誘導(dǎo)率分別為96%、93%。

4.4 ‘小白杏胚誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成不定芽誘導(dǎo)率優(yōu)于葉片，因此，‘小白杏的胚比葉片更容易誘導(dǎo)出愈傷組織及不定芽。

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