植物代謝組學(xué)研究進(jìn)展

郭鳳丹+王興軍+侯蕾+趙術(shù)珍+厲廣輝+夏晗

摘要：代謝組學(xué)是一門新興的交叉學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，目前已被廣泛應(yīng)用于動物、植物、微生物等研究領(lǐng)域。本文簡要介紹了代謝組學(xué)的檢測技術(shù)及數(shù)據(jù)處理方法，概述了代謝組學(xué)在植物代謝途徑以及代謝組遺傳基礎(chǔ)研究中的進(jìn)展，包括不同植物材料、不同環(huán)境條件尤其是逆境脅迫下的代謝譜分析以及代謝相關(guān)QTL定位、功能基因鑒定等，分析了代謝組學(xué)發(fā)展過程中的問題，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：植物；代謝組學(xué)；研究方法；代謝譜；遺傳基礎(chǔ)；進(jìn)展

中圖分類號：S188：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0154-09

Abstract Metabolomics is an important branch of system biology and has been widely used in studies of plants， animals and microorganism. In this article， the detection technologies and data processing methods of metabolomics were introduced briefly. The research progresses of metabolomics in understanding plant metabolic pathways and genetics of metabolome were summarized， including metabolic profiling of different plant materials under different environmental conditions especially the stress conditions， mQTL mapping and identification of functional genes. The problems present in the metabolomics studies were also discussed， and the prospective application metabolomics was previewed.

Keywords Plant； Metabolomics； Research method； Metabolic profiling； Genetic basis； Progress

近年來，組學(xué)技術(shù)成為探索生命奧秘的重要手段，繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，代謝組學(xué)也迅速發(fā)展起來，成為系統(tǒng)生物學(xué)的一個重要組成部分。它旨在對生物體組織或細(xì)胞特定時期下的全部小分子代謝物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，主要反映生物體的生理和生化狀態(tài)[1]。傳統(tǒng)的代謝概念包括合成代謝和分解代謝，代謝產(chǎn)物也包括中間代謝產(chǎn)物和最終代謝產(chǎn)物，因此廣義上的代謝物應(yīng)包括所有參與生物體內(nèi)生命活動的分子。但為了有別于基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，代謝組目前只涉及相對分子質(zhì)量約小于1 000 D的小分子代謝物質(zhì)[2]。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的不斷改進(jìn)、數(shù)據(jù)庫的積累和生物信息學(xué)的發(fā)展，代謝組學(xué)得到快速發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于動物、植物和微生物等諸多研究領(lǐng)域[3]。植物內(nèi)源代謝物種類繁多，總數(shù)有20萬～100萬種[4]，對生命過程中這些代謝物進(jìn)行全面的定性定量研究，對于后基因組時代全面認(rèn)識植物生命活動十分必要[5]。代謝組學(xué)旨在發(fā)掘生命現(xiàn)象的分子結(jié)果，豐富組學(xué)研究內(nèi)容，通過與其他組學(xué)技術(shù)整合，將生命過程和結(jié)果有機(jī)結(jié)合分析，在功能基因鑒定、代謝途徑解析及自然變異的遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。本文簡要綜述了代謝組學(xué)研究方法及在植物代謝規(guī)律和遺傳基礎(chǔ)研究中的進(jìn)展。

1 植物代謝組學(xué)研究方法

植物代謝組學(xué)分析一般包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、植物栽培及取樣、樣品制備和預(yù)處理、代謝產(chǎn)物的分離和鑒定、數(shù)據(jù)的分析和解釋。由于植物代謝物尤其是次生代謝物種類繁多、結(jié)構(gòu)迥異，根據(jù)研究對象及目的不同，代謝組學(xué)分析的具體步驟會有所不同，采用的分離鑒定手段及數(shù)據(jù)分析方法也會各不相同。

植物代謝物的種類和含量除受遺傳及環(huán)境因素影響外，還與樣品的提取制備過程關(guān)系緊密。為了獲得穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果，樣品制備需要考慮試驗(yàn)材料的生長、取樣的時間和地點(diǎn)、取樣量及樣品的處理方法等問題。為真實(shí)反映代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)的存在信息，采集樣品后需立即阻斷材料內(nèi)在酶的活性，通常采用冷凍/液氮降溫法保存材料，抑制代謝反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生，待使用時取出均質(zhì)粉末[6]。代謝產(chǎn)物提取和分離的方法要根據(jù)目標(biāo)組分的分子結(jié)構(gòu)、溶解性、極性等理化性質(zhì)以及所選用的分析技術(shù)進(jìn)行選擇，通常選用的萃取溶劑為水或甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿、乙腈、己烷等溶劑。在代謝物分析之前，通常先用固相萃取、固相微萃取、親和色譜等方法進(jìn)行預(yù)處理[7]。

代謝組分析技術(shù)包括代謝物的分離、檢測及鑒定。目前，代謝產(chǎn)物的分離技術(shù)主要有氣相色譜（gas chromatography， GC）、液相色譜（liquid chromatography， LC）和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis， CE）等。檢測及鑒定技術(shù)主要有質(zhì)譜（mass spectrometry， MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）、庫侖分析、傅立葉變換-紅外光譜（FT-IR）、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測和光散射等。分離技術(shù)與檢測技術(shù)的不同組合就形成了不同的代謝組學(xué)分析技術(shù)。目前，常用分析手段是核磁共振，氣相色譜、液相色譜、毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用等。

針對代謝物組學(xué)分析技術(shù)，2010年之前主要瓶頸在于可以鑒定的代謝物種類較少，通常在100種以內(nèi)，這就使組學(xué)價值大打折扣。隨著技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)在的代謝組學(xué)實(shí)測可以達(dá)到300種代謝物以上。迄今，還沒有一種代謝組學(xué)分析方法能夠涵蓋所有的代謝物，多種分析平臺聯(lián)合使用是對單一分析技術(shù)的補(bǔ)充，以達(dá)到對不同極性代謝物的廣譜分析。

針對核磁共振技術(shù)新開發(fā)的魔角旋轉(zhuǎn)（magic anglespinning，MAS）[8]、磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）和活體磁共波譜（vivo magnetic resonance spectroscopy， MRS）[9]等技術(shù)進(jìn)一步促進(jìn)了核磁共振在材料活體部位代謝組分析中的應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)有直接進(jìn)樣和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用兩種方式。傅立葉變換-離子回旋共振-質(zhì)譜（fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS）、飛行時間質(zhì)譜（time of flight-mass spectroscopy，TOFMS）、軌道阱質(zhì)譜（orbitrap）等適合于直接進(jìn)樣的質(zhì)譜分析技術(shù)得到了發(fā)展，在未知化合物的確定上發(fā)揮了很大作用[10]。另外，電噴霧萃取電離（extractive electrospray ionization， EESI）、實(shí)時直接分析（direct analysis in real time， DART）、解析電噴霧離子化（desorption electrospray ionization， DESI）等新型離子化技術(shù)的發(fā)展也促進(jìn)了直接進(jìn)樣質(zhì)譜在代謝組學(xué)中的應(yīng)用[11]。針對色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，二維氣相色譜（GC×GC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用[12]和二維液相色譜（LC×LC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用技術(shù)[13]提升了代謝物分離效率，增加了峰容量，提高了檢測靈敏度，從而擴(kuò)展了代謝譜的分析范圍。親水相互作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）技術(shù)的出現(xiàn)改善了強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性小分子物質(zhì)的分離狀況，已廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究[14]。此外，微流體色譜（microfluidics）和超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography， SFC）等新型色譜技術(shù)以其強(qiáng)大的分辨能力，將進(jìn)一步促進(jìn)代謝組學(xué)研究的發(fā)展[15，16]。

代謝組學(xué)通過儀器分析得到的數(shù)據(jù)是一個龐大的多維矩陣，為了充分獲取數(shù)據(jù)中的潛在信息，常用化學(xué)計(jì)量學(xué)中的模式識別方法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和歸類處理，將其轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合多變量分析的數(shù)據(jù)形式。常用的模式識別方法主要有無監(jiān)督方法（unsupervised method）和有監(jiān)督方法（supervised method）兩種。無監(jiān)督方法應(yīng)用最多的有主成分分析（principal components analysis， PCA）、自組織映射（self-organizing mapping， SOM）、非線性映射（non-linear mapping， NLM）、系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis， HCA）等。有監(jiān)督方法主要包括偏最小二乘法（partial least squares， PLS）、線性判別分析（linear discrimination analysis， LDA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks， ANN）等。

代謝組學(xué)建立數(shù)學(xué)模型的目的是為了從海量數(shù)據(jù)中提取有用的生物信息，篩選出在生理、病理或逆境響應(yīng)中重要的生物標(biāo)記物。而獲取信息的前提是利用生物信息學(xué)對未知代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定或注釋[17]。近年來，建立了一系列公共代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫資源，如MassBank （http：//www.massbank.jp/）、KEGG COMPOUND （http：//www.genome.jp/kegg /compound/）、KNApSAcK （http：//kanaya.naist.jp/KNApSAcK/）、Plant metabolome database （PMDB） （ http：//www.sastra.edu/scbt/pmdb/）、LipidMaps （http：//www.lipidmaps.org/），以及整合了四大小分子數(shù)據(jù)庫KEGG、HMDB、Lipid Maps、BioCyc的新的統(tǒng)計(jì)分析程序MetaboLyzer[18]。

盡管目前國內(nèi)外在代謝組學(xué)研究平臺及技術(shù)開發(fā)方面取得了不少進(jìn)展，但仍無法滿足代謝組學(xué)研究的需要，還需繼續(xù)開發(fā)高效可靠的研究方法及技術(shù)手段。

2 植物代謝組學(xué)研究進(jìn)展

植物代謝物分為兩大類，初生代謝物和次生代謝物。初生代謝物為維持植物生長發(fā)育和生命活動所必須，次生代謝物則更多地參與植物抗病、抗逆等環(huán)境因子應(yīng)答。在植物生長發(fā)育過程中，任何內(nèi)外因素的影響都可能引起植物代謝物含量或代謝流的變化。由于代謝物處在植物系統(tǒng)生化活動的末端，反映的是已經(jīng)發(fā)生的生物學(xué)事件，所以相對于其他組學(xué)，代謝組學(xué)更能反映植物體的生理和生化狀態(tài)，因此被越來越廣泛地應(yīng)用于植物生物學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的研究中。代謝組學(xué)在植物中的應(yīng)用主要集中在兩個層面，一是代謝譜分析，包括不同基因型、不同生態(tài)型植物的代謝產(chǎn)物比較，代謝途徑研究，不同環(huán)境條件對代謝物的影響以及抗逆代謝組學(xué)研究等；二是遺傳代謝組學(xué)（genetical metabolomics），即用來解析植物代謝的遺傳基礎(chǔ)，包括代謝相關(guān)QTL定位、功能基因鑒定及代謝途徑解析等。

2.1 不同植物材料的代謝組分析

對不同基因型材料間尤其是突變體或基因改造植物與野生型材料間的代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較，對于篩選優(yōu)良品種或基因、評價基因改造效果及進(jìn)行功能基因組學(xué)研究有重要意義。Mumm等[19]采用6個代謝組學(xué)平臺對31種不同基因背景及來源稻米的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)茉莉香米（jasmine）和印度香米（basmati）存在代謝上的差異，對于解釋稻米改良育種過程中稻米質(zhì)量、生化組成和基因型之間的潛在聯(lián)系提供了新的研究思路，并為稻米品種改良提供種質(zhì)材料及技術(shù)路線。為了解稻米直鏈淀粉含量與米粒外觀、淀粉顆粒結(jié)構(gòu)等表型特征的關(guān)系，Kusano等[20]采用基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)對五種不同直鏈淀粉比例的粳稻和兩種基因敲除突變體粳稻的代謝物變化進(jìn)行分析，為水稻育種相關(guān)代謝性狀及其潛在遺傳基礎(chǔ)研究提供了有用信息。Chen等[21]利用GC/LC-MS對擬南芥硫苷合成酶基因CYP79F1的兩個RNAi株系進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一些氨基酸、糖類、多肽和激素等代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，同時通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，兩組數(shù)據(jù)對于進(jìn)一步了解擬南芥硫苷代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及后續(xù)增強(qiáng)植物抗性和質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

除了不同基因型，利用代謝組學(xué)技術(shù)對同一植物不同發(fā)育時期或不同組織器官的代謝物種類和含量進(jìn)行研究也具有重要意義。Aharoni等[22]采用FT-MS對草莓果實(shí)成熟過程中一系列代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化過程進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，從而對草莓的成熟機(jī)制有了進(jìn)一步了解。Park等[23]采用GC/MS方法對不同栽培年限的人參根部樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果顯示，人參環(huán)氧炔醇（panaxydol）和人參炔醇（panaxynol）含量隨栽培年份增加而升高，可以作為鑒別人參年限的關(guān)鍵組分。賈巖等[24]采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對不同發(fā)育階段的款冬花（Tussilago farfare）次生代謝物的合成規(guī)律進(jìn)行分析，并聯(lián)合高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選關(guān)聯(lián)酶基因，為款冬花次生代謝物的生物合成調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。Ahmad等[25]采用GC/MS對馬來西亞重要的油料作物小蓼（Polygonum minus）根莖葉中的揮發(fā)性代謝組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)癸醛和月桂醛是其香氣的主要貢獻(xiàn)者，且三帖化合物在葉中大量富集，為小蓼揮發(fā)性組分植物化學(xué)譜（phytochemical profiles）的研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 不同生境下植物代謝組研究

植物代謝過程尤其是次生代謝過程及代謝物的富集受環(huán)境中各種生物和非生物因素的影響，利用代謝組學(xué)研究不同生境下植物代謝產(chǎn)物的差別，不僅能夠深入了解植物與環(huán)境的相互作用，還能揭示植物表型與生長發(fā)育及生物多樣性的關(guān)系。這類研究常用于藥用植物鑒別和質(zhì)量控制。

我國藥材種類繁多，來源復(fù)雜，中藥基原品種的真?zhèn)巍⒄谂c否，直接關(guān)系到藥材療效，即使同一種藥材，產(chǎn)地及自然條件不同，藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量也不相同，臨床療效也有較大差異，因此有“道地藥材”的說法。代謝組學(xué)分析可廣泛應(yīng)用于中藥基原品種鑒定及不同生態(tài)型不同產(chǎn)地藥材的品質(zhì)鑒定與質(zhì)量控制。傳統(tǒng)中藥柴胡有兩種來源，分別是柴胡Bupleurum chinense D.C.和狹葉柴胡B. scorzonerifolium Willd.，俗稱“北柴胡”和“南柴胡”，傳統(tǒng)的色譜分析方法均不能對兩者進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，Qin等[26]采用基于1H-NMR的代謝組學(xué)找到了區(qū)分兩個種的標(biāo)志物，體現(xiàn)了1H-NMR代謝組學(xué)在中藥種類鑒別及質(zhì)量評價中的獨(dú)特優(yōu)勢。沙棘是典型的多基原藏藥，劉悅等[27]采用1H-NMR代謝組學(xué)結(jié)合DNA條形碼技術(shù)發(fā)掘了3種沙棘遺傳和生化特征的差異性，能對3種沙棘進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。韓正洲等[28]采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對栽培型和野生型野菊花的整體代謝物組成進(jìn)行比較分析，發(fā)掘了可以區(qū)分兩種野菊花的特征性化學(xué)成分，為其質(zhì)量評價提供了有效手段。鄭文等[29]采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對不同產(chǎn)地來源的蟲草化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的蟲草在有效成分種類和相對量上存在一定差異，其中西藏產(chǎn)的蟲草質(zhì)量最高，說明代謝組學(xué)技術(shù)可用于蟲草藥材的真?zhèn)巍a(chǎn)地、品質(zhì)等的評價。另外，由于藥用植物的活性成分多為次生代謝產(chǎn)物，基于次生代謝和生態(tài)環(huán)境的密切相關(guān)性，有學(xué)者提出通過選擇具有一定環(huán)境壓力的次適宜生態(tài)環(huán)境來解決藥用植物栽培中生長和次生產(chǎn)物累積的矛盾的觀點(diǎn)[30-32]。利用代謝組學(xué)研究藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成累積機(jī)制及其影響因素，對于指導(dǎo)藥材栽培、提高藥效成分含量具有重要意義。

2.3 逆境脅迫下植物代謝組研究

凡是對植物生長發(fā)育不利的環(huán)境條件統(tǒng)稱為逆境或脅迫。植物在長期進(jìn)化過程中，在生長習(xí)性、生理、代謝等方面逐漸形成了各種應(yīng)對逆境脅迫的適應(yīng)對策。植物對逆境脅迫的耐受性和敏感性是一個復(fù)雜的生物過程，其中最重要的是代謝的改變，即植物通過調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)以誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列特殊代謝物，從而達(dá)到對生物、非生物脅迫的防御作用。對植物尤其是農(nóng)作物的抗逆生理及分子機(jī)制已經(jīng)有大量研究，但對植物如何響應(yīng)各種逆境脅迫依然缺乏深入系統(tǒng)的了解。代謝組學(xué)可以通過監(jiān)測植物體系受到脅迫或刺激后代謝產(chǎn)物的變化來揭示脅迫環(huán)境下植物的應(yīng)答機(jī)制，是植物抗逆研究很好的途徑。因此，代謝組學(xué)已成為研究植物逆境脅迫下代謝途徑變化和耐受機(jī)理的重要手段[33]。代謝組學(xué)與其它組學(xué)技術(shù)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)）的整合，更有助于人們從整體上把握植物脅迫應(yīng)答機(jī)制。

干旱是限制植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，也是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的全球性問題。Urano等[34]采用GC/TOF-MS和CE-MS方法對野生型擬南芥和NCED3基因（ABA合成相關(guān)基因）敲除突變體（nc3-2）在干旱脅迫下的代謝變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下nc3-2突變體中有46種代謝物上調(diào)，野生型中有61種上調(diào)。與野生型相比，突變體中一些受ABA調(diào)控的代謝物增幅較小，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、葡萄糖、果糖及乙醇胺等；另一方面，一些不受ABA調(diào)控的代謝物增幅較大，如棉子糖、檸檬酸鹽、丙氨酸等。這些結(jié)果為探究干旱脅迫下植物代謝分子機(jī)制提供了新數(shù)據(jù)。

Fumagalli等[35]利用1H-高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（1H-high-resolution magic angle spinning， HR MAS）和NMR對兩個水稻栽培品種（Arborio和Nipponbare）在干旱和高鹽脅迫下的代謝組學(xué)進(jìn)行研究，地上部和根部試驗(yàn)結(jié)果表明，Arborio幼苗對兩種非生物脅迫較Nipponbare更敏感。PCA分析顯示氨基酸和糖類在脅迫條件下顯著積累，其中，Arborio幼苗的積累量較Nipponbare高，兩栽培品種間存在明顯差異。

Nam等[36，37]以野生型水稻Hwayoung和過表達(dá)AtCYP78A7基因（編碼細(xì)胞色素P450蛋白）的耐旱轉(zhuǎn)基因水稻為材料，利用1H-NMR和GC平臺分別對其地上部和籽粒在不同水分環(huán)境下的代謝組進(jìn)行分析。在不同生長階段（分蘗期、抽穗期和成熟期）不同基因型水稻均能被很好地區(qū)分，土壤水分條件在一定程度上影響水稻代謝組。在抽穗期，兩基因型間由于糖類含量不同形成的明顯區(qū)分只在水分缺失條件下出現(xiàn)，說明水稻基因型對代謝組的影響受生長階段和水分條件的限制。籽粒代謝組結(jié)果顯示，正常澆水和干旱條件下不同基因型的水稻均能得到很好區(qū)分，基因型的不同導(dǎo)致了氨基酸和糖類水平的差異。與野生型水稻相比，在轉(zhuǎn)基因水稻中，干旱條件顯著提高了籽粒γ-氨基丁酸、果糖、葡萄糖、甘油、甘氨酸和乙醇含量。這些代謝物的變化可能通過一些脅迫響應(yīng)通路起作用來提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱能力。

土壤中可溶性鹽分過多對植物造成危害稱為鹽害或鹽脅迫。我國土壤鹽漬化現(xiàn)象嚴(yán)重，鹽漬土面積大、分布廣、類型多，對植物尤其是農(nóng)作物耐鹽機(jī)理的研究具有重要意義。Johnson等[38]以兩種對鹽脅迫敏感程度不同的番茄株系Edkawy和Simge F1為材料，利用傅立葉變換-紅外光譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對果實(shí)的代謝指紋圖譜進(jìn)行分析。有監(jiān)督的DFA分析方法能夠區(qū)分兩種基因型對照和高鹽處理組的果實(shí)；采用遺傳算法（genetic algorithms， GA）鑒別應(yīng)答鹽脅迫潛在的重要功能物質(zhì)，包括飽和及不飽和腈化物、含氰化合物、氨基自由基和含氮化合物等。Gong等[39]利用GC-MS和生物芯片技術(shù)研究了耐鹽植物鹽芥（Thellungiella halophila）和擬南芥在鹽脅迫下代謝物的差別。與擬南芥相比，鹽芥在無鹽和高鹽環(huán)境中均具有較高的代謝水平；在150 mmol/L NaCl處理下，鹽芥的代謝響應(yīng)更為復(fù)雜，糖類、糖醇、有機(jī)酸和無機(jī)離子等的代謝水平均較擬南芥高。

Widodo等[40]對耐鹽性不同的兩種大麥（Hordeum vulgare）Sahara和Clipper在鹽脅迫下的代謝反應(yīng)分析顯示，鹽敏感型大麥Clipper中包括脯氨酸和γ-氨基丁酸等氨基酸以及聚胺腐胺的含量升高，這些代謝產(chǎn)物的積累與植株的緩慢生長和葉片壞死率有關(guān)；而在耐鹽型大麥Sahara中，己糖磷酸、三羧酸循環(huán)中間體及參與細(xì)胞保護(hù)的代謝物含量均升高，推測其與Sahara葉片的細(xì)胞保護(hù)和對高Na+的耐受有關(guān)。Shelden等[41]同樣對Sahara和Clipper應(yīng)對鹽脅迫的代謝差異進(jìn)行了研究，不同處在于其是以大麥根尖的根冠/細(xì)胞分裂區(qū)、伸長區(qū)和成熟區(qū)三個結(jié)構(gòu)區(qū)為研究對象，鑒定了76個已知的差異代謝物，從組織和細(xì)胞水平增強(qiáng)了對植物耐鹽機(jī)制的理解。Wu等[42]比較了野生型大麥和栽培大麥在鹽脅迫下的代謝差異，結(jié)果顯示，滲透調(diào)節(jié)是大麥應(yīng)對鹽脅迫的基本機(jī)制，野生型大麥耐鹽性較強(qiáng)、生長較快，在鹽脅迫下，其葉綠素和相容性溶質(zhì)含量相對較高，而栽培種主要通過增加糖酵解和能量消耗來應(yīng)對高鹽脅迫。

Richter等[43]利用GC-MS技術(shù)對耐鹽性不同的兩個玉米雜交種在鹽脅迫下的代謝組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，耐鹽品種中葡萄糖、果糖和蔗糖的積累增強(qiáng)了其對鹽脅迫的適應(yīng)能力。Yang等[44]對普通野生大豆和耐鹽野生大豆在鹽堿脅迫下的代謝組進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)耐鹽品種中絕大部分有機(jī)酸和脯氨酸的含量增加，TCA循環(huán)在普通大豆中增強(qiáng)，在耐鹽大豆中反而減弱，說明普通大豆的耐鹽機(jī)制是通過增強(qiáng)TCA循環(huán)產(chǎn)生更多ATP來應(yīng)對逆境條件，而耐鹽品種可能通過調(diào)節(jié)氨基酸及有機(jī)酸合成來產(chǎn)生更多相容性溶質(zhì)。

除了干旱和鹽堿脅迫，極端溫度、金屬離子污染等也會對植物生長產(chǎn)生不利影響。Jin等[45]對耐寒性不同的兩個煙草品種K326和CB-1在冷脅迫下的代謝組進(jìn)行分析，GC-MS和LC-MS檢測到200個差異代謝物，其中，氨基酸和糖類如葡萄糖、果糖、肌醇等在耐寒品種K326中有較高的積累量，此外，一些次級代謝產(chǎn)物在兩品種中的積累量也不同。

代謝組學(xué)在植物遭受生物脅迫的研究中也得到廣泛應(yīng)用。Scandiani等[46]以抗病能力不同的兩種大豆NA 4613 （敏感型）和DM 4670 （部分抗感染型）為材料，對南美大豆猝死綜合癥病菌（Fusarium tucumaniae）感染早期的根系代謝組進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，接種后7天，一些氨基酸和多胺類物質(zhì)在感病品種中有較高積累量，利用這些特征能夠?qū)善贩N進(jìn)行區(qū)分。

2.4 植物代謝組的遺傳基礎(chǔ)研究

代謝組學(xué)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物代謝組的遺傳基礎(chǔ)研究及代謝相關(guān)功能基因鑒定中。植物組織中的代謝物水平作為代謝性狀（m-traits），往往也是受多基因控制的數(shù)量性狀，因此，可以運(yùn)用數(shù)量性狀座位（quantitative trait loci， QTL）作圖對各種代謝物含量進(jìn)行遺傳分析[47]。大多數(shù)代謝性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究材料都是通過雜交或回交獲得的連鎖群體。

為了研究植物代謝與生物量積累的關(guān)系，Meyer等[48]以擬南芥重組自交系（RIL）群體為材料，對其初生代謝物進(jìn)行QTL分析，共檢測到84個代謝物的157個QTLs和6個生物量相關(guān)QTLs。Matsuda等[49]為了揭示水稻籽粒代謝表型的遺傳背景，對水稻回交群體進(jìn)行了大規(guī)模的代謝物QTL（mQTL）分析，共鑒定出759個代謝物的802個mQTLs。其中，大部分代謝物積累水平的廣義遺傳力較低，對環(huán)境因子較為敏感，如糖類和氨基酸，而一些次級代謝物如黃酮類化合物的廣義遺傳力較高。進(jìn)一步通過連鎖分析對黃酮合成途徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了分析。Li等[50]以粳稻（Lemont）和秈稻（特青）的重組自交系群體為材料，利用代謝組學(xué)結(jié)合生長測定來定位QTL從而對其初級代謝物的遺傳變異進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，水稻初級代謝物的廣義遺傳力較低，絕大多數(shù)mQTLs只有小到中度的效應(yīng)，兩個代謝相關(guān)的QTL熱點(diǎn)對富含碳氮的代謝物有著相反的作用，表明他們可能影響碳氮代謝平衡。

Gong等[51]以一個有高密度SNP圖譜的水稻重組自交系群體[52]為研究對象，對其劍葉和發(fā)芽種子進(jìn)行代謝組分析及mQTL作圖，共鑒定出900個代謝物的超過2 800個mQTLs。對mQTLs的全基因組分布研究顯示，代謝物的遺傳調(diào)控存在明顯的熱點(diǎn)區(qū)域，利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)從部分精度較高、遺傳效應(yīng)較大的位點(diǎn)中鑒定獲得24個控制代謝物水平的候選基因。通過mQTL遺傳互作的分析，對水稻黃酮類物質(zhì)的代謝途徑進(jìn)行了重構(gòu)。為了研究大麥中影響啤酒膠體穩(wěn)定性的遺傳機(jī)制，Ye等[53]利用大麥Franklin/Yerong雙單倍體（DH）群體對酒精冷渾濁（ACH）QTL進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個相關(guān)QTL，qACH。由蛋白質(zhì)組分析鑒定出的兩個關(guān)鍵渾濁活性蛋白基因（BATI-CMb和BATI-CMd）與qACH位于染色體的同一位置，推測BATI-CMb和BATI-CMd是qACH的候選基因，控制著啤酒膠體的穩(wěn)定性。對Franklin和Yerong中BATI-CMb和BATI-CMd核酸和氨基酸序列的多態(tài)性分析可以開發(fā)相應(yīng)的基因分子標(biāo)記，用于大麥的分子輔助選擇育種。多平臺的代謝組學(xué)分析與mQTL的聯(lián)合研究對于代謝相關(guān)功能基因的鑒定和代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建有著重要意義。

mQTL定位在植物遺傳代謝組學(xué)研究中取得許多進(jìn)展，但該方法局限于連鎖群體的使用，存在重組位點(diǎn)少、群體構(gòu)建費(fèi)時費(fèi)力、無法覆蓋多個不同品種等問題。隨著高通量基因分型檢測技術(shù)的發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）結(jié)合代謝組學(xué)已成為植物數(shù)量遺傳學(xué)研究強(qiáng)有力的工具[54]。

Chan等[55]為了研究擬南芥中硫代糖苷代謝途徑的遺傳結(jié)構(gòu)，采用GWAS對96個擬南芥品種包含40多個硫代糖苷表型性狀進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，每個發(fā)育階段與硫代糖苷關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)都不相同。采用共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（co-expression network）方法從數(shù)量龐大的GWAS位點(diǎn)中篩選出許多影響硫代糖苷積累的候選基因。Wen等[56]從368份玉米自交系中鑒定出983個代謝物，利用GWAS定位了1 459個性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。進(jìn)一步通過自交系群體的eQTL（expression QTL）與RIL群體的mQTL對mGWAS顯著位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，并利用重測序和候選基因關(guān)聯(lián)分析鑒定出5個典型候選基因的潛在變異。Chen等[57]通過對529個水稻自然變異群體的廣泛靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)合mGWAS分析，檢測出634個控制代謝物自然變異的顯著遺傳位點(diǎn)。通過數(shù)據(jù)挖掘注釋了36個調(diào)控生理、營養(yǎng)相關(guān)代謝物的候選基因，并進(jìn)一步利用遺傳和生化分析手段鑒定了其中5個候選基因。Matsuda等[58]采用mGWAS方法解析水稻次級代謝物自然變異的遺傳結(jié)構(gòu)，從175份水稻自然品種中鑒定出89個代謝物的323個顯著位點(diǎn)，數(shù)據(jù)分析顯示大部分代謝性狀只與少量的強(qiáng)QTLs緊密關(guān)聯(lián)。Dong等[59]采用代謝組學(xué)結(jié)合GWAS對水稻中酚胺的時空積累模式進(jìn)行研究，定位了多個控制酚胺含量自然變異的位點(diǎn)，并通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證了兩個亞精胺羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶的候選基因。基于mGWAS技術(shù)從基因到代謝水平的分析已成為功能基因鑒定和以組學(xué)為基礎(chǔ)的作物遺傳改良的有用工具。

QTL分析及GWAS促進(jìn)了植物代謝組學(xué)與功能基因組學(xué)的研究，但兩者在應(yīng)用上各有利弊，將兩者結(jié)合起來，并整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)更有助于從整體上把握植物代謝的遺傳機(jī)制。Wu等[60]將多種單一方法（GWAS、RIL、IL、代謝組-轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)分析）進(jìn)行整合對擬南芥初級代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子進(jìn)行研究，利用mGWAS方法從314個擬南芥自然品種中定位了94個初級代謝物的617個顯著位點(diǎn)，然后將這些位點(diǎn)與先前發(fā)表的利用擬南芥RILs和 ILs群體鑒定的mQTLs數(shù)據(jù)進(jìn)行比較驗(yàn)證，同時，利用已報道的擬南芥轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)構(gòu)建代謝-轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，來進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定的位點(diǎn)。經(jīng)過綜合分析，共得到92個主要的位點(diǎn)，從中篩選出76個代謝候選基因，并進(jìn)一步通過功能缺失突變體驗(yàn)證了兩個分別與酪氨酸降解和β-丙氨酸代謝相關(guān)的新基因。整合數(shù)量遺傳學(xué)與網(wǎng)絡(luò)分析的綜合方法能夠大大提高位點(diǎn)鑒定的靈敏性和精確度。

組學(xué)聯(lián)合技術(shù)也同樣被應(yīng)用于作物抗逆代謝組學(xué)的遺傳基礎(chǔ)研究中。Jin等[45]對冷脅迫下兩種耐寒性煙草品種進(jìn)行代謝組學(xué)分析的同時，也對其進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，分別從CB-1和K326中鑒定出14 590和14 605個差異表達(dá)基因（DEGs），其中有約50%為冷誘導(dǎo)基因，且耐寒品種K326中大部分冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)變化程度高于CB-1。為了挖掘小麥赤霉病抗性QTL區(qū)間內(nèi)的有效基因，Dhokane等[61]采用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合研究了攜帶抗性和敏感性等位基因（QTL-Fhb2）的小麥重組自交系，結(jié)合側(cè)翼標(biāo)記序列分析，鑒定出4-香豆酸：CoA連接酶（4CL）、胼胝質(zhì)合成酶（CS）、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH041）轉(zhuǎn)錄因子、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（ABC4）和肉桂醇脫氫酶（CAD）位點(diǎn)為QTL-Fhb2區(qū)域內(nèi)潛在的抗性基因，有助于構(gòu)建植物響應(yīng)赤霉病的完整分子機(jī)制。Ma等[62]對兩個不同耐旱水稻品種（不耐旱品種IRAT109和耐旱品種IAC1246）進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析，來探究干旱脅迫下維持光合作用的關(guān)鍵代謝途徑。在干旱和水分充足條件下，分別從兩品種中鑒定出4 059、2 677個差異表達(dá)基因以及67、49個差異代謝物，其中6個差異代謝物以及215個DEGs與滲透勢和抗氧化能力顯著相關(guān)。在耐旱品種IAC1246中，4-羥基肉桂酸和阿魏酸與光合作用相關(guān)DEGs的上調(diào)趨勢一致，因此，4-羥基肉桂酸和阿魏酸被認(rèn)為是水稻抗旱關(guān)鍵代謝物，其代謝途徑中的DEGs則有望成為耐旱候選基因。這說明以代謝物為基礎(chǔ)并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法是篩選抗旱基因的一種有效方法。

3 問題與展望

代謝組學(xué)是一門交叉學(xué)科，其與生物科學(xué)、分析化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)及生物信息學(xué)等多種學(xué)科密切相關(guān)，是系統(tǒng)生物學(xué)研究中的一個重要環(huán)節(jié)。隨著分析檢測技術(shù)的發(fā)展，特別是基于質(zhì)譜及核磁共振的代謝譜分析的發(fā)展，代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。但作為一門新興學(xué)科，代謝組學(xué)仍處于發(fā)展階段，仍然面臨著許多亟待解決的問題，如檢測靈敏度的提高，通用檢測方法的開發(fā)，無偏性、高通量定量分析的實(shí)現(xiàn)以及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)注釋的完備等。自動化、標(biāo)準(zhǔn)化、完整化的代謝組學(xué)研究技術(shù)是未來的發(fā)展方向。

在植物代謝研究方面，代謝組學(xué)將單一、少量的代謝物分析發(fā)展成整體或某個層面的海量代謝數(shù)據(jù)的研究，突破了研究層面窄的局限性。尤其是通過對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等其他組學(xué)數(shù)據(jù)的整合，為植物代謝途徑及遺傳結(jié)構(gòu)的研究開辟了新局面。然而，各類組學(xué)分析方法在應(yīng)用上各有優(yōu)缺點(diǎn)，如何根據(jù)研究目標(biāo)、對象及試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇合適的技術(shù)手段或從已有的海量數(shù)據(jù)中選取有用的信息，是研究者們需要不斷探討的問題。隨著分離檢測技術(shù)的不斷提高、多平臺數(shù)據(jù)的綜合應(yīng)用以及生物信息學(xué)的發(fā)展，代謝組學(xué)將在闡述生物過程的分子機(jī)理中發(fā)揮不可替代的作用。

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