miR—222基因、ERα、膠原蛋白在陰道前壁膨出患者陰道壁中的表達(dá)

馬喆　鮑俊翠　王慧軍　肖愛民　李小蘭　李環(huán)

[摘 要] 目的：檢測(cè)miR-222基因、雌激素受體α（ERα）、膠原蛋白在陰道前壁膨出（AVP）患者陰道壁中的表達(dá)，分析其臨床價(jià)值。方法：2014年6月至2016年3月，選取40例AVP患者（AVP組）和同期40例接受其他婦科手術(shù)的良性病變患者（對(duì)照組）。按照月經(jīng)狀態(tài)，再分為絕經(jīng)前亞組、絕經(jīng)后亞組，檢測(cè)各組患者陰道壁miR-222基因、ERα及膠原蛋白表達(dá)情況，計(jì)算各指標(biāo)間相關(guān)性并分析其臨床意義。結(jié)果：AVP組絕經(jīng)前、絕經(jīng)后亞組陰道壁miR222高于對(duì)照組相應(yīng)亞組，其ERα及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組相應(yīng)亞組，兩組內(nèi)比較絕經(jīng)后亞組miR-222表達(dá)水平高于絕經(jīng)前亞組，其ERα表達(dá)水平低于絕經(jīng)前亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)性分析可見miR-222與ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：miR-222表達(dá)增加所致ERα含量下降以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平的減少，是引發(fā)AVP的重要機(jī)制，注重絕經(jīng)前后上述指標(biāo)變化的監(jiān)測(cè)有望為AVP的診斷及靶向治療提供一定參考。

[關(guān)鍵詞] miR-222基因；雌激素受體α；膠原蛋白；陰道前壁膨出

中圖分類號(hào)：R711 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2017）05-078-03

DOI：10.11876/mimt201705032

陰道前壁膨出（AVP）是最常見的盆腔器官脫垂（POP）類型，盆底支持組織結(jié)構(gòu)與功能完整性的破壞對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1]。目前，臨床對(duì)AVP的發(fā)病機(jī)制尚無明確闡釋，多數(shù)研究認(rèn)為，年齡、妊娠及分娩、肥胖、遺傳等與AVP相關(guān)[2]，絕經(jīng)后女性AVP呈上升趨勢(shì)，可能與雌激素水平變化有關(guān)[3]。此外，有學(xué)者認(rèn)為，POP的發(fā)生與結(jié)締組織變化亦具有密切關(guān)聯(lián)，如膠原蛋白代謝異常者有著更高的POP發(fā)生率，且治療后復(fù)發(fā)率較高[4]。此次研究檢測(cè)miR-222基因、雌激素受體α（ERα）及膠原蛋白在AVP患者陰道壁中的表達(dá)，旨在進(jìn)一步了解AVP發(fā)生機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象與分組

征得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，2014年6月至2016年3月期間40例于我院接受手術(shù)的AVP患者納入AVP組；同期40例因?yàn)槠渌夹詪D科疾病需行手術(shù)患者納入對(duì)照組。兩組均排除合并惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、婦科急性炎癥者以及既往有盆底手術(shù)史或術(shù)前3個(gè)月內(nèi)有雌激素藥物使用史者?；颊呔橥獠⒑炇鹬橥鈺?，再按照患者月經(jīng)狀態(tài)分為絕經(jīng)前亞組、絕經(jīng)后亞組。

1.2 檢測(cè)方法

術(shù)中取患者陰道前壁組織，以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法，檢測(cè)miR-222基因相對(duì)表達(dá)水平 [5]；使用免疫組化法，檢測(cè)ERα[6]，一抗為兔抗人多克隆ERα抗體（美國Santa Cruz公司），二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體（英國Abcam公司）；采用免疫組化S-P法，通過平均陽性染色面積百分比對(duì)I 型、III型膠原蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)[7]，試劑盒購自杭州江萊ELISA檢測(cè)中心。

1.3 結(jié)果判讀

miR-222表達(dá)水平判讀[8]：在目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相同的前提下，以U6為內(nèi)參，測(cè)定循環(huán)閾值（Ct值），計(jì)算△Ct（△Ct=miR-222 Ct值-U6 Ct值），以2-△△Ct表示miR-222表達(dá)水平；ERα表達(dá)水平判讀[9]：染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞核ERα表達(dá)情況，棕黃色染色為陽性細(xì)胞，于400×視野下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞內(nèi)陽性染色強(qiáng)弱、陽性細(xì)胞百分率，二者乘積為ERα表達(dá)水平，其中，染色強(qiáng)弱計(jì)分0～3分，依次為無棕黃色染色、淺黃色染色、深黃色染色、深棕色染色；陽性細(xì)胞百分率計(jì)分0～4分，依次為0、1%～25%、26%～50%、51%～75%/、76%～100%；膠原蛋白表達(dá)水平判讀[10]：在光鏡下觀察所有染色切片，I、III型型膠原蛋白以細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺棕色或者棕黃色為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不互相重復(fù)的×200視野，拍照后運(yùn)用Image-Pro Plus計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算I型 、III型膠原蛋白所占面積百分比，即相對(duì)陽性染色面積平均值（%），得出I型、III型膠原蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

指標(biāo)表達(dá)組間比較采用t檢驗(yàn)，使用Pearson相關(guān)性分析，計(jì)算各指標(biāo)間相關(guān)性，SPSS18.0處理數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者陰道壁各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況

AVP組絕經(jīng)前、絕經(jīng)后亞組陰道壁miR222高于對(duì)照組相應(yīng)亞組，其ERα及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組相應(yīng)亞組，兩組患者組內(nèi)比較，絕經(jīng)后亞組miR-222表達(dá)水平高于絕經(jīng)前亞組，其ERα表達(dá)水平低于絕經(jīng)前亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-222與ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（P<0.05）。

3 討論

女性盆底由盆底肌、韌帶、筋膜等結(jié)構(gòu)組成，共同形成盆底支持結(jié)構(gòu)，在維持膀胱、尿道、陰道、子宮和直腸等盆腔器官正常位置中發(fā)揮著重要作用[11]。盆底結(jié)構(gòu)的松弛可引發(fā)POP，包括AVP、陰道頂端脫垂、陰道后壁脫垂等，其中AVP最為常見，且往往伴隨陰道分泌物增多、陰道脫出物、下尿路癥狀、腸道癥狀、性功能障礙等 [12]。

一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，老年女性POP發(fā)生率高達(dá)32.8%，且人群中約有11%～19%的POP患者需手術(shù)治

療[13]。隨著人口老齡化的加劇，POP發(fā)生率不斷上升，已成為影響全球婦女健康和生活質(zhì)量的疾患。endprint

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種小分子非編碼RNA，可調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄過程，參與生物體的發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等活動(dòng)，其中，miR-222是一種高度保守的非編碼小分子RNA，與ERα存在靶向調(diào)控關(guān)系，且已有研究證實(shí)miR-222在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演的重要角色[14]。此次研究從絕經(jīng)前后不同狀態(tài)觀察AVP患者發(fā)病機(jī)制，結(jié)果表明，女性絕經(jīng)后miR-222表達(dá)水平大幅增加，AVP患者陰道壁miR-222表達(dá)水平高于非AVP患者，且miR-222與ERα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說明miR-222、ERα可能參與了AVP的發(fā)展，其機(jī)制可能為：隨著女性年齡的增加，雌激素等內(nèi)分泌指標(biāo)的變化可能引發(fā)miR-222過表達(dá)，而miR-222過表達(dá)可下調(diào)ERα表達(dá)、降低雌激素敏感性，進(jìn)而影響陰道和盆底正常組織結(jié)構(gòu)，造成盆底結(jié)構(gòu)支撐力下降，以及陰道前壁松弛、膨出[15-16]。

在盆底支持組織中，子宮主韌帶、子宮骸韌帶以及肛提肌均發(fā)揮著重要作用，其中，韌帶的主要成分包括平滑肌、結(jié)締組織，而膠原蛋白是結(jié)締組織的重要組成部分，約占機(jī)體全部蛋白的25%以上[17]。盆底組織主要由Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原組成，Ⅰ型硬度大、直徑粗，主要分布于皮膚、肌肉、骨骼、韌帶等組織，發(fā)揮支持作用；Ⅲ型彈性大、直徑較細(xì)，主要調(diào)控組織彈性。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例平衡才能維持女性盆底結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[18]。本研究結(jié)果中AVP患者陰道壁Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平均較非AVP患者顯著下降，是導(dǎo)致盆底結(jié)締組織膠原變細(xì)、抗張能力不足的主要原因，而上述病理變化也是造成盆腔支持能力不足特別是AVP的主要原因。

綜上所述，AVP患者陰道壁miR-222基因高表達(dá)，ERα、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平顯著下降，且miR-222、ERα表達(dá)水平與患者月經(jīng)狀態(tài)具有一定關(guān)聯(lián)，尋求高選擇性雌激素受體以逆轉(zhuǎn)ERα下降、探索改善盆腔組織彈性及支持力的方法，有望為AVP的治療提供新的思路與方向。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Jelovsek， Eric J， Maher， et al. Pelvic organ prolapse[M]// Practical Functional Urology. Springer International Publishing， 2007：15-26.

[2] Ward R M， Edwards D R V， Edwards T， et al. Genetic epidemiology of pelvic organ prolapse： a systematic review[J]. Am J Obstet Gynecol， 2014， 211（4）： 326-335.

[3] Zhou L， Shangguan A J， Kujawa S A， et al. Estrogen and Pelvic Organ Prolapse[J]. J Mol Genet Med， 2016， 10（221）： 1747-1862.

[4] Weber A M， Richter H E. Pelvic organ prolapse.[J]. Obstet Gynecol， 2005， 106（3）：615.

[5] Jeon M J， Kim E J， Lee M， et al. MicroRNA‐30d and microRNA‐181a regulate HOXA11 expression in the uterosacral ligaments and are overexpressed in pelvic organ prolapse[J]. J Cell Mol Med， 2015， 19（2）： 501-509.

[6] Maldonado P A， Montoya T I， Acevedo J F， et al. Effects of vaginal conjugated equine estrogens and ospemifene on the rat vaginal wall and lower urinary tract[J]. Biol Reprod， 2016， 96（1）： 81-92.

[7] Liapis A， Bakas P， Pafiti A， et al. Changes of collagen type III in female patients with genuine stress incontinence and pelvic floor prolapse[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol， 2001， 97（1）：76.

[8] 胡芝. miR-221和miR-222在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義[D]. 溫州：溫州醫(yī)學(xué)院， 2010.

[9] Han L， Wang L， Wang Q， et al. Association between pelvic organ prolapse and stress urinary incontinence with collagen[J]. Exp Ther Med， 2014， 7（5）： 1337-1341.

[10] 高芳圓. 盆底支持組織中轉(zhuǎn)化生長因子β_1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)與盆底功能障礙性疾病的關(guān)系[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)， 2011.

[11] Alarab M， Kufaishi H， Lye S， et al. Expression of extracellular matrix-remodeling proteins is altered in vaginal tissue of premenopausal women with severe pelvic organ prolapse[J]. Reprod Sci， 2014， 21（6）： 704-715.endprint

[12] Vasavada S P， Barber M D. Anterior Vaginal Prolapse[J]. Pelvic Floor Dysfunction， 2006：207-215.

[13] Allen-Brady K， Cannon-Albright L A， Farnham J M， et al. Evidence for pelvic organ prolapse predisposition genes on chromosomes 10 and 17[J]. Am J Obstet Gynecol， 2015， 212（6）： 771.

[14] 許踐剛. miR-221和miR-222在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及臨床意義[D]. 溫州：州醫(yī)學(xué)院， 2010.

[15] Kufaishi H， Alarab M， Drutz H， et al. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse[J]. Reprod Sci， 2016， 23（8）： 978-992.

[16] Rhee S H， Zhang P， Hunter K， et al. Pelvic organ prolapse is associated with alteration of sphingosine-1-phosphate/Rho-kinase signalling pathway in human vaginal wall[J]. J Obstet Gynaecol， 2015， 35（7）： 726-732.

[17] Veit-Rubin N， Cartwright R， Singh A U， et al. Association between joint hypermobility and pelvic organ prolapse in women： a systematic review and meta-analysis[J]. Int Urogynecol J， 2016， 27（10）： 1469-1478.

[18] Kim T， Sridharan I， Ma Y， et al. Identifying distinct nanoscopic features of native collagen fibrils towards early diagnosis of pelvic organ prolapse[J]. Nanomedicine， 2016， 12（3）： 667-675.endprint