基于Pyk2通路探討加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠的作用

王菊霞，陳小英，陳雪蘭，劉 文，鄭 京

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

基于Pyk2通路探討加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠的作用

王菊霞，陳小英，陳雪蘭，劉 文，鄭 京

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

目的 基于Pyk2通路探討加味四君子湯對阿霉素腎病大鼠的作用。 方法 將實驗用SD大鼠30只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組及中藥組，誘導(dǎo)阿霉素腎病大鼠模型。中藥組在阿霉素注射后第7天予中藥灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。實驗的第7、21、35天分別檢測各組24 h尿蛋白定量及電鏡下觀察大鼠腎組織；檢測各組腎組織中Nephrin、Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA、Pyk2、Pyk2磷酸化蛋白水平 （pPyk2）及pPyk2／Pyk2比值。 結(jié)果 ①24 h尿蛋白定量：模型組較正常組明顯升高（P＜0.01），中藥組較模型組降低（P＜0.05）。② Nephrin及Nephrin mRNA水平：第21、35天，模型組較正常組均明顯減少（P＜0.01），中藥組較模型組增高（P＜0.05）。③ Pyk2 mRNA水平：第21、35天，模型組和中藥組比正常組均升高（P＜0.05），但第35天，中藥組比模型組明顯減少（P＜0.01）。 ④ pPyk2、pPyk2／Pyk2比值：第 21、35天，模型組較正常組均有上升（P＜0.05和＜0.01），而中藥組比模型組均有降低（P＜0.01）。 結(jié)論 阿霉素可通過損傷足細(xì)胞，抑制Nephrin蛋白，激活Pyk2蛋白磷酸化引起腎病綜合癥的發(fā)生；加味四君子湯可抑制阿霉素腎病大鼠腎組織中Pyk2激活，上調(diào)Nephrin蛋白水平，改善腎組織足突病變，減少尿蛋白，進(jìn)而保護(hù)腎小球的濾過屏障作用。

阿霉素腎??；24 h 尿蛋白定量；Nephrin；Nephrin mRNA；Pyk2；pPyk2；Pyk2 mRNA；加味四君子湯

加味四君子湯是治療脾腎氣虛型腎病綜合征常用方劑，目前已在臨床上大量應(yīng)用，取得了很好療效，并能減少蛋白尿，但該方作用機(jī)制尚未明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：阿霉素腎病大鼠腎臟損傷與FAKmRNA、蛋白及其磷酸化的表達(dá)有關(guān)，加味四君子湯能抑制阿霉素腎病大鼠腎組織中黏著斑激酶（FAK）活化，有效降低蛋白尿［1］。而 Pyk2 是一種胞質(zhì)酪氨酸激酶，是FAK家族的第2個成員，與FAK密切聯(lián)系。他們都參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移及有絲分裂和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程［2］。Du1等［3］發(fā)現(xiàn)Pyk2介導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，而FAK可以抑制PyK2自磷酸化、黏著定位和肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，這暗示著FAK和 PyK2之間的平衡對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的遷移和細(xì)胞的生長具有重要作用。另有研究［4-5］發(fā)現(xiàn)：在FAK基因失活或敲除的情況下，Pyk2出現(xiàn)代償性增多。但在腎臟中，二者的關(guān)系尚未見報道，Pyk2和FAK在腎病中的相互關(guān)系也不明確。中藥治療蛋白尿的作用是否與Pyk2有一定的聯(lián)系需要進(jìn)一步的證明。本項目研究阿霉素腎病大鼠模型腎組織中Pyk2 mRNA、Pyk2蛋白表達(dá)及磷酸化（pPyk2）水平及加味四君子湯對其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動物模型建立 健康雄性SD大鼠（由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供）30只，體質(zhì)量180～220 g。用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、中藥組各10只。模型組和中藥組經(jīng)尾靜脈按6.5 mg／kg一次性注射鹽酸阿霉素注射液（海正藥業(yè)股份有限公司），正常組經(jīng)尾靜脈一次性注射同等量生理鹽水。7 d后，每日早上八至九點(diǎn)，中藥組以加味四君子湯 20 mL／（kg·d）灌胃，正常組與模型組以同等量生理鹽水灌胃。分別于第21、35天摘取各組5只SD大鼠的雙腎，沿矢狀面剖開，一部分放入10%福爾馬林中以備免疫組化，一部分放入戊二醛固定液中以備電鏡觀察。

1.2 加味四君子湯制備 組方：生黃芪30 g，赤茯苓 12 g，白術(shù) 12 g，丹參 15 g，黨參 10 g，山萸肉 12 g，淮山藥 30 g，生薏苡仁 30 g，蓮子肉 30 g，當(dāng)歸15 g，金櫻子15 g，桑寄生15 g。制法：① 按比例稱取生藥226 g，浸泡30 min后，用電爐大火加熱至沸騰，再轉(zhuǎn)文火煎煮30 min后過濾；② 濾渣中加水，大火加熱至沸騰后，再文火煎20 min，再過濾；③ 將兩次濾液混合均勻，加熱濃縮至226 mL，相當(dāng)于原材料1.0 g／mL。中藥材由福建省藥材公司提供，在福建省人民醫(yī)院制劑科統(tǒng)一加工。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 24 h尿蛋白定量測定 分別于第7、21、35天，收集3組SD大鼠24 h尿液，通過雙縮脲比色法檢測尿蛋白水平。

1.3.2 腎組織電鏡檢查 取腎皮質(zhì)約1 mm×1 mm×1 mm，先用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）固定（含有3%戊二醛和0.22 mmol／L蔗糖），再用1%鋨酸后固定，并逐級乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋，后用透射電子顯微鏡（日立公司HU-12A型）進(jìn)行腎臟超微病理學(xué)檢查。

1.3.3 免疫組化檢測Nephrin水平及圖像分析采用二步法，應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對每例標(biāo)本隨機(jī)選取8個視野進(jìn)行半定量分析，分析得出nephrin的免疫組化染色光密度，計算其陽性積分光密度（IOD）值，為Nephrin水平。具體操作步驟詳見參考文獻(xiàn)［6］。

1.3.4 Rt-PCR檢測 Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA水平 每個樣品取腎組織約50mg，按照經(jīng)典方法用Trizol試劑、氯仿和異丙醇進(jìn)行抽提 mRNA。具體操作步驟詳見參考文獻(xiàn)［6］。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測Pyk2、pPyk2水平 將腎組織塊稱量后用勻漿器攪碎，按1∶10的比例在勻漿中加入相應(yīng)的裂解液進(jìn)行裂解，離心機(jī)離心后取上清液，用BCA法測定Pyk2蛋白濃度。加入buffe緩沖液后，100℃溫度下變性，取20 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，5 g／L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（磷酸化Pyk2抗體，總Pyk2抗體，德國CST公司），4℃孵育過夜，同上洗膜后，以山羊抗兔二抗（1∶4 000）孵育 1 h，TBST洗滌充分后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X光片顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用方差分析法，采用多元相關(guān)分析法分析不同變量間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 3組24 h尿蛋白定量比較 見表1。

表1 3組24 h尿蛋白定量比較（x±s）mg／24 h

2.2 3組腎臟組織形態(tài)圖 見圖1。電鏡觀察：正常組腎小球足細(xì)胞足突排列整齊、清晰，未見微絨毛變性及融合；模型組可見腎小球足細(xì)胞腫脹，足突部分或彌漫性融合；中藥組腎小球病變和模型組比較有明顯改善，僅見部分足突融合。

圖1 3組腎臟組織電鏡下形態(tài)圖（×10 000）

2.3 3組腎組織Nephrin免疫組化染色圖像及水平 見圖 2，表 2。

圖2 3組腎組織nephrin免疫組化染色圖像比較（PV 兩步法，×400）

表2 3組腎組織Nephrin水平比較（x±s）

2.4 3組腎組織中 Nephrin mRNA、Pyk2 mRNA水平比較 見表3。

表3 3組腎組織中Nephrin、PyK2 mRNA水平比較（x±s）

2.5 3組腎組織 Pyk2、pPyk2及 pPyk2／Pyk2比較見圖3。

2.6 多元相關(guān)性分析 尿蛋白與PyK2 mRNA、pPyk2／Pyk2 比值呈正相關(guān)（r值分別為 0.653、0.926；P 值分別為 0.003、0.000）。

3 討 論

腎病綜合征臨床類型很多，其中微小病變型最主要臨床特點(diǎn)是大量蛋白尿、低蛋白血癥，而蛋白尿生成病理機(jī)制中最為關(guān)鍵的是腎小球濾過屏障受損［7］。腎小球足細(xì)胞足突間裂孔隔膜是腎小球濾過膜屏障重要組成部分［8］。研究表明Nephrin是構(gòu)成裂孔隔膜拉鏈狀結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)蛋白［9］，Nephrin的減少被證明與蛋白尿和腎臟病的進(jìn)展有關(guān)［10－11］。

圖 3 3組腎組織 Pyk2、pPyk2及 pPyk2／Pyk2比較

既往研究表明：機(jī)械牽拉下誘導(dǎo)的大鼠腎臟纖維化的實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)腎小管中的Pyk2蛋白表達(dá)水平明顯增多［12］，而內(nèi)皮素-1（ET-1）刺激系膜細(xì)胞則可以引起Ca2+／PKC依賴的Pyk2活化，進(jìn)而促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖以及腎小球硬化、纖維化［13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：隨著蛋白尿的增多，阿霉素腎病大鼠腎組織中Pyk2 mRNA及pPyk2／Pyk2比值升高，提示Pyk2基因及磷酸化蛋白表達(dá)的相對升高可能參與阿霉素腎病大鼠蛋白尿的產(chǎn)生［6］。以上研究均表明Pyk2的激活與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為腎病發(fā)生的主要病機(jī)是由于稟賦不足，久病體虛，加之起居不慎，外邪入里，損傷肺脾腎，導(dǎo)致肺脾腎三臟虧虛，運(yùn)化水液功能失常，封藏失職，水濕停聚，泛溢肌膚，故而出現(xiàn)水腫；精微不能輸布，封藏而下泄，則出現(xiàn)蛋白尿、低蛋白血癥。本病本在脾腎，標(biāo)為風(fēng)、濕、熱、瘀、濁，臨床常見虛實夾雜，相互影響，相互作用，從而導(dǎo)致病情反復(fù)，遷延難愈。加味四君子湯是國家中醫(yī)藥管理局“十一五”重點(diǎn)專科“水腫”（原發(fā)性腎病綜合征）驗證方案專用處方之一，方中生黃芪補(bǔ)益肺脾之氣，補(bǔ)氣運(yùn)陽以利水，啟上源，助脾運(yùn)；黨參性甘溫，補(bǔ)中益氣，助黃芪之力；山茱萸性酸、微溫，補(bǔ)益肝腎，既能補(bǔ)精固澀，又能助陽溫運(yùn)水濕；薏苡仁、茯苓健脾，利水滲濕；白術(shù)、淮山藥補(bǔ)氣健脾，益氣養(yǎng)陰，扶土制水；當(dāng)歸、丹參補(bǔ)血行氣，活血化瘀。諸藥合用，具有補(bǔ)脾益腎，養(yǎng)血攝精，利水消腫之功效。浙江省中醫(yī)院李學(xué)銘教授常用此方治療脾腎氣虛型腎病，藥后患者水腫、短氣、乏力、腰膝酸軟、納差、體瘦等癥狀得到明顯改善，且具有明顯降低尿蛋白作用［14］?，F(xiàn)代研究證實其能改善脾虛證患者的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，降低循環(huán)免疫復(fù)合物水平，提高NK細(xì)胞活性，并且可以減少大鼠腎小球NF-kB陽性表達(dá)，抑制腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多，降低阿霉素腎病大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮水平。

本研究發(fā)現(xiàn)：加味四君子湯能夠抑制Pyk2磷酸化，降低pPyk2／Pyk2比值，減輕足細(xì)胞損傷，減少尿蛋白，從而延緩腎病的進(jìn)一步發(fā)展。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0027-03

2017-09-05

福建省教育廳科技項目A類（JA13161）

王菊霞（1974—），女，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事小兒內(nèi)科的臨床工作。