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    太子參通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

    2018-01-09 06:50:18林少兵蔣宗勝阮君山王少明
    福建中醫(yī)藥 2017年6期
    關(guān)鍵詞:恒溫箱太子參信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

    林少兵 ,蔣宗勝 ,阮君山 ,2,王少明 ,2

    (1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院,福建 福州350001;2.福建省立醫(yī)院中醫(yī)藥分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州350001;3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州350122)

    太子參通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

    林少兵1,蔣宗勝3,阮君山1,2,王少明1,2

    (1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院,福建 福州350001;2.福建省立醫(yī)院中醫(yī)藥分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州350001;3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州350122)

    目的 通過(guò)太子參及主要成分環(huán)肽B(HB)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的影響,研究其相關(guān)作用機(jī)制。 方法 CAM雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)測(cè)定太子參對(duì)血管生成的影響;CCK8檢測(cè)法檢測(cè)HB對(duì)HUVEC的增殖和毒性;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HB對(duì)HUVEC增殖和遷移的影響;ELISA檢測(cè)HB通過(guò)影響哪種細(xì)胞生長(zhǎng)因子影響HUVEC的生長(zhǎng)發(fā)育;Western Blot測(cè)定MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各蛋白的表達(dá),分析其相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果 太子參具有促進(jìn)血管生成的作用;0~100 μg/mL HB可促進(jìn)HUVEC增殖;隨著時(shí)間推移,HUVEC快速地向劃痕中間遷移,并且隨著HB濃度的增加,HUVEC遷移的速度和強(qiáng)度也隨著增強(qiáng);HB通過(guò)影響VEGF的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖;HB通過(guò)激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖。 結(jié)論 太子參具有促進(jìn)血管生成的作用,作用機(jī)制與激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)細(xì)胞的增殖有關(guān)。

    太子參;環(huán)肽B;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;血管生成

    血管生成是指從已有毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新血管[1],主要包括:血管基底膜降解;血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移;重建形成新血管和血管網(wǎng),是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的復(fù)雜過(guò)程。血管生成是目前研究熱點(diǎn),涵蓋幾乎所有臨床學(xué)科,尤其是心血管和腫瘤領(lǐng)域的研究較為突出[2]。

    太子參為石竹科太子參屬植物,主要成分為太子參多糖、多種氨基酸和微量元素。有研究表明:太子參具有抗氧化的特性[3],且對(duì)心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[4],但當(dāng)前作用機(jī)制尚未明朗。本研究以環(huán)肽B(HB)促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖為切入點(diǎn),進(jìn)一步研究太子參促進(jìn)血管生成的作用機(jī)制,為太子參在血管生成領(lǐng)域提供更合理的用藥依據(jù)。

    1 材 料

    1.1 試劑 SPF種雞蛋(福建省大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司);重組人血管內(nèi)皮抑制素(商品名:恩度,山東先聲麥得津生物制藥有限公司);重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(商品名:貝復(fù)舒,珠海億勝生物制藥有限公司);HUVEC(上海漢博生物科技有限公司);HB(成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司);DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗(青霉素-鏈霉素溶液,美國(guó)通用醫(yī)療生命科學(xué)有限公司);CCKB試劑、Westem Blot試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);VEGF165試劑盒(武漢云克隆有限公司);FGF2試劑盒(武漢云克隆有限公司);Erk1/2、Mek1 /2、Raf-1(上海斯信生物科技有限公司);β-actin、IgG(H+L)(北京麥爾泰克科技有限公司)。太子參水提物由福建省立醫(yī)院制劑室自制。

    1.2 培養(yǎng)條件 HUVEC于36.9℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基加15%血清和1%雙抗。

    2 方 法

    2.1 CAM雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)測(cè)定太子參對(duì)血管增殖的影響 配制濃度為2、5、10 mg/mL的太子參水提物。選擇表面清潔,蛋殼均質(zhì)的SPF種雞蛋,孵育于5%CO2、36.9℃恒溫箱。孵蛋至第 8天,酒精消毒蛋殼表面,去除蛋殼,剪除卵殼膜(大概1.5 cm×1.5 cm),制備假氣室[5]。將滅菌后的濾紙以1 cm×1 cm的規(guī)格剪取,作為載體置于CAM中。制作成功的 CAM 模型分成空白組、低(2 mg/mL)、中(5 mg/mL)、高(10 mg/mL)劑量組,每組 8 個(gè) CAM 模型,做好標(biāo)記。用微量加樣器將0.06 mL藥物滴到各組載體中,加完藥后用透明膠封閉加藥窗,放入5%CO2、36.9℃恒溫箱中繼續(xù)孵育,連續(xù)加藥3 d。3 d后,由加藥窗滴入甲醛∶丙酮=1∶1的固定液預(yù)固定 15 min,待CAM的血管完全凝固后,用眼科鑷完整剪下CAM中心待觀察區(qū)域,置于蒸餾水中,吸管吹打CAM,使其舒展開(kāi)來(lái),立即拍照保存。使用相關(guān)軟件分析圖像,根據(jù)管徑將血管分類:管徑≥0.1 mm為大血管;0.1 mm>管徑≥0.05 mm為中血管;管徑<0.05 mm為小血管。

    在確定最適合細(xì)胞生長(zhǎng)藥物濃度后,用同樣的方法將制作成功的CAM模型分成空白組、最適合細(xì)胞生長(zhǎng)藥物濃度組、貝復(fù)舒組、恩度組,每組8個(gè)CAM模型,觀察各組藥物對(duì)血管增殖的影響。

    2.2 CCK8檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞增殖和毒性 制備HUVEC細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),稀釋細(xì)胞懸液,以每孔2 000個(gè)HUVEC接種到96孔板中,5%CO2、36.9℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h 后,以 8 濃度梯度(0、20、30、50、60、80、100、150、200 μg/mL) 6 個(gè)復(fù)孔的形式加入 HB。 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,每個(gè)孔加20 μL CCK8試劑,CCK8作用1.5、3、4 h時(shí),在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)各孔吸光度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值[6]。

    2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HB對(duì)HUVEC增殖和遷移的影響 用marker筆在6孔板背后劃?rùn)M線,大約每隔0.5~1 cm一道。在6孔板中選4個(gè)孔,每孔加入70 μL(約含 5×105個(gè) HUVEC)細(xì)胞懸液,放入 5%CO2、36.9℃恒溫箱。待細(xì)胞鋪滿板孔,用槍頭比著直尺,垂直于背后的橫線劃痕,用PBS洗去劃下的細(xì)胞,加入 0、30、60、90 μg/mL HB 組的培養(yǎng)基,放入5%CO2、36.9℃恒溫箱。 在 0、6、12、24 h 時(shí)拍照,記下劃痕的間距。做3次實(shí)驗(yàn),算平均值。

    2.4 ELISA檢測(cè) VEGF、FGF2的表達(dá)情況 將HUVEC 分為 4 組,每組含 0、30、60、90 μg/mL HB,設(shè)5個(gè)孔,培養(yǎng)24 h。24 h后,用0.25%胰酶消化,離心收集細(xì)胞,將收集到的細(xì)胞用冷 PBS洗3次,制備PBS細(xì)胞懸液。取適量 PBS重懸細(xì)胞,用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液,使細(xì)胞急劇震蕩破裂,反復(fù)凍融3次,使細(xì)胞溶脹破碎。于 2~8℃ 500 g離心10 min,收集上清備用。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書的操作檢測(cè)VEGF、FGF2的表達(dá)情況。

    2.5 Western Blot檢測(cè)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白表達(dá)情況 取一個(gè)培養(yǎng)瓶的細(xì)胞,用預(yù)冷過(guò)的PBS 洗 3 遍,加裂解液 300 μL(RIPA 裂解液∶PMSF=100∶1),30 min 后,用槍頭刮下細(xì)胞(此操作在冰上進(jìn)行),12 000 rpm,冷凍離心 10 min,取上清液200 μL,加入 SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液 40 μL,98℃高溫變性10 min,BCA法檢測(cè)蛋白含量。SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,加一抗,4℃過(guò)夜,TBST洗5次,加二抗,孵育2 h,TBST洗5次,加發(fā)光劑ECL化學(xué)發(fā)光。將膠片掃描存檔,凝膠圖像分析目標(biāo)帶的光密度值。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用SPSS22.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以(x±s)表示,采用 t檢驗(yàn)。

    3 結(jié) 果

    3.1 CAM雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn) 雞胚在5%CO2、36.9℃恒溫箱正常發(fā)育,孵育40個(gè),成功37個(gè),制作成功率為92.5%??瞻捉MCAM膜與載體融合,部分中、小血管貫穿;低劑量組的中、小血管較多,沒(méi)有大血管,血管呈點(diǎn)狀分布,血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.2 cm內(nèi);中劑量組的血管增生最多,平均每個(gè)雞胚有2.1根大血管,中、小血管的密集,血管呈樹(shù)突狀分布,血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.5 cm內(nèi);高劑量組的雞胚在加藥后死亡2個(gè),基本沒(méi)有大、中血管,有大量細(xì)小血管圍繞,細(xì)小血管以載體為中心呈包繞或放射狀分布。因此最適合細(xì)胞生長(zhǎng)藥物濃度組為中劑量組。

    貝復(fù)舒組血管增生最多,大、中血管比較多,每個(gè)雞胚有2~4根大血管,呈樹(shù)突狀分布,血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.8 cm內(nèi);恩度組抑制作用非常明顯,雞胚只存活2個(gè),且存活雞胚的血管多為零星分布的細(xì)小血管。如表1所示,中劑量組與空白組比較,血管數(shù)有顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明太子參有促進(jìn)血管生成的作用。

    表1 各藥物組與空白組血管數(shù)比較(x±s) 根

    3.2 CCK8檢測(cè)法檢測(cè)HB對(duì)HUVEC的增殖和毒性 實(shí)驗(yàn)顯示HB影響HUVEC的增殖,如圖1所示:0~100 μg/mL HB 促進(jìn) HUVEC 增殖,150、200 μg/mL HB抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

    3.3 HB促進(jìn)HUVEC增殖和遷移 如圖2、表2所示,隨著時(shí)間的推移,HUVEC快速地向劃痕中間遷移,并且隨著HB濃度增加,HUVEC遷移的速度和強(qiáng)度也隨著增強(qiáng),與空白組比較,愈合程度有顯著性差異(P<0.05)。

    3.4 HB通過(guò)增加VEGF的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖 如圖3所示:隨著HB濃度的增加,VEGF的表達(dá)隨著增加,不同濃度間VEGF的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05),F(xiàn)GF2的表達(dá)不受環(huán)肽 B濃度影響。

    圖1 不同濃度HB作用后測(cè)得的HUVEC吸光度值

    表2 不同濃度HB在不同時(shí)間劃痕的愈合程度(x±s)%

    圖2 不同濃度HB在不同時(shí)間劃痕的愈合程度

    圖3 ELISA檢測(cè)VEGF、FGF2的表達(dá)情況

    3.5 HB 激活 MAPK(Ras/Raf/Mek/Erk)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn) HUVEC細(xì)胞增殖 Ras/Raf/Mek/Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為MAPK眾多信號(hào)通路中的一個(gè),是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,參與HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HUVEC 細(xì) 胞 中 Kras、Raf-1、Mek1 /2、Erk1/2 的 表達(dá)水平,結(jié)果如圖4所示:隨著HB濃度的增加,HUVEC 細(xì)胞中 Kras、Raf-1、Mek1/2、Erk1/2 蛋白的表達(dá)水平顯著增加,與空白組比較,有顯著性差異(P<0.05)。

    圖 4 HUVEC 細(xì)胞中 Kras、Raf-1、Mek1/2、Erk1/2 蛋白的表達(dá)情況

    4 討 論

    應(yīng)用藥物刺激小血管生長(zhǎng),促進(jìn)血管生成,已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。CAM是雞胚外的一層膜,主要功能是提供氣體交換的表面,其功能依賴于致密的血管網(wǎng)支撐,正是由于雞胚發(fā)育過(guò)程中大量尿囊膜血管的形成,為研究血管發(fā)生和形成提供了良好的模型[7]。本研究表明:太子參能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移,且作用比較緩和,此結(jié)果為太子參治療相關(guān)疾病提供新的依據(jù)。

    血管生成過(guò)程復(fù)雜,與多種細(xì)胞因子有關(guān)。目前,對(duì)促進(jìn)血管生成的血管生成因子研究最多的為FGF和VEGF。本研究利用ELISA的敏感性、高特異性檢測(cè)HB對(duì)HUVEC中FGF和VEGF的影響情況,證明HB是通過(guò)影響VEGF的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。

    目前已知,所有真核細(xì)胞中均存在Ras/Raf/Mek/Erk這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,VEGF、源生長(zhǎng)因子(PDGF)等與其受體結(jié)合后,可通過(guò)刺激 Ras-二磷酸鳥苷(GDP)轉(zhuǎn)換為 Ras-三磷酸鳥苷(GTP),從而導(dǎo)致Ras激酶過(guò)度活化,進(jìn)而以這種自體磷酸化方式激活 Ras/Raf/Mek /Erk 信號(hào)通路[8],啟動(dòng)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖分化。本文通過(guò)測(cè)定 Ras/Raf/Mek/Erk 這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:隨著HB濃度的增加,各蛋白的表達(dá)水平也隨著增加,說(shuō)明HB通過(guò)Ras/Raf/Mek/Erk這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖。但各蛋白的表達(dá)水平并不呈規(guī)則的趨勢(shì)上升,考慮其不只是影響 Ras/Raf/Mek/Erk 這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,還通過(guò)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖,這需要更多的研究予以證實(shí)。

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    R285.5

    A

    1000-338X(2017)06-0016-04

    2017-09-18

    國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273647);福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013J01365);福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才重點(diǎn)項(xiàng)目(2015-ZQN-ZD-2);國(guó)家衛(wèi)計(jì)委共建科學(xué)研究基金項(xiàng)目(WKJ-FJ-19)

    林少兵(1983—),男,主管藥師,主要從事藥學(xué)工作。

    王少明(1958—),男,主任藥師,碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:cnfjwsm@163.com

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