氯代烯烴脅迫下菌群SWA1的降解活性及群落結(jié)構(gòu)

趙天濤 ,邢志林 ,張麗杰 ,項(xiàng)錦欣 ,何 芝 ,楊 旭 ,高艷輝 (.重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶400054；2.重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院,重慶 400044)

氯代烯烴在生產(chǎn)生活中的不當(dāng)存儲(chǔ)和使用,使其在空氣、水和土壤環(huán)境中廣泛存在,由于它們具有擴(kuò)散范圍廣、降解持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)和生物毒性強(qiáng)等特點(diǎn),對(duì)自然環(huán)境造成了嚴(yán)重污染.生物降解具有反應(yīng)條件溫和、成本低和無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì),長(zhǎng)期以來(lái)開(kāi)展了大量研究.目前研究者已經(jīng)分離得到了可降解氯代烯烴的菌株,對(duì)純菌株降解氯代烯烴的途徑有了深入認(rèn)識(shí),如二氯乙烯(DCE)可以作為微生物唯一碳源實(shí)現(xiàn)去除[1];DCE和 TCE可通過(guò)共代謝途徑發(fā)生降解[2-5];四氯乙烯(PCE)可在脫鹵酶的作用下轉(zhuǎn)化為低氯代化合物[6].

盡管分離的純菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下能夠?qū)崿F(xiàn)污染物降解,但在實(shí)際應(yīng)用中往往面臨環(huán)境適應(yīng)性差和降解活性持續(xù)時(shí)間短的問(wèn)題[7],如Dehalococcoides屬微生物能夠?qū)崿F(xiàn)PCE的完全脫氯,但在高濃度污染物的復(fù)雜環(huán)境下極易失去活性[8].此外,環(huán)境中氯代烯烴污染物的完全降解往往是多種微生物共同的作用結(jié)果[9-10],已有研究證實(shí)多種微生物混合比單一培養(yǎng)微生物降解氯苯氧基苯酚,聚乙二醇和氯酚化合物等污染物效果更高[11].更重要的是,在現(xiàn)有技術(shù)條件下,可分離培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的 0.1%～1.0%,未分離培養(yǎng)的微生物在復(fù)雜環(huán)境中對(duì)污染物的作用可能更為重要[12].因此,篩選高活性混合菌在污染物降解中具有更大的應(yīng)用潛力.

近年來(lái),許多研究者基于水環(huán)境沉積物馴化富集的混合微生物分析了氯代烯烴耐受性及降解情況.大多以TCE作為氯代烯烴中的典型污染物,其耐受濃度變化范圍為 9～146mg/L[4,13-15],結(jié)果表明高濃度TCE對(duì)微生物生長(zhǎng)及活性有顯著影響,當(dāng)達(dá)到 146mg/L,已無(wú)甲烷氧化發(fā)生[13].實(shí)際污染場(chǎng)地中生物降解作用使污染物發(fā)生轉(zhuǎn)化,降解不完全造成有毒副產(chǎn)物的顯著積累,如 PCE的不完全脫氯會(huì)造成TCE和DCE的大量積累,所以系統(tǒng)考察微生物對(duì)多種不同類型氯代烯烴的耐受性是必要的.以混合菌為生物介質(zhì)對(duì)氯代烯烴耐受性研究中,只發(fā)現(xiàn)Choi等[13]考察了混合菌群對(duì)TCE和PCE的耐受性,PCE濃度范圍為0.199～0.796mg/L.當(dāng)前氯代烯烴的生物降解研究中,濃度多維持在小于 10mg/L的范圍[16-17],混合菌的低耐受性限制了其在高污染場(chǎng)地的應(yīng)用,關(guān)于高耐受,可高效降解氯代烯烴混合菌的研究鮮有報(bào)道.

填埋場(chǎng)覆蓋層長(zhǎng)期受高濃度、成分復(fù)雜污染物馴化,衍生了多種環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的功能微生物,在氯代烴污染物生物降解領(lǐng)域具有很大應(yīng)用潛力[18-19].基于 TCE馴化后的填埋場(chǎng)覆蓋層,課題組富集篩選了混合菌群 SWA1,前期研究表明菌群SWA1具有高的群落結(jié)構(gòu)多樣性,甲烷為底物可共代謝高效降解 TCE[20].在此基礎(chǔ)上,本研究將利用菌群SWA1考察其對(duì)3種典型氯代烯烴的耐受性：通過(guò)監(jiān)測(cè)高濃度氯代烯烴條件下甲烷氧化能力和菌體生長(zhǎng)特性分析混合菌的生物活性;檢測(cè)氯代烴濃度變化及氯離子產(chǎn)生速率評(píng)估氯代烴共代謝降解能力;利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定不同種類氯代烯烴不同濃度馴化后混合菌群的多樣性變化,確定高耐受菌種豐度,有效降解氯代烴微生物種類,明確這些微生物的相互作用關(guān)系.研究結(jié)果以期為高耐氯代烯烴混合菌的篩選和應(yīng)用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 混合菌的馴化富集

試驗(yàn)用混合菌分離于重慶長(zhǎng)生橋(29°35'N,106°33'E)生活垃圾填埋場(chǎng)覆蓋土.該混合菌命名為SWA1,最適生長(zhǎng)溫度為30℃,最佳pH值為7.0.可以甲烷為唯一碳源生長(zhǎng),生長(zhǎng)特性參見(jiàn)前期研究[20].

1.2 氯代烯烴耐受性實(shí)驗(yàn)

量取25mL滅菌N-NMS培養(yǎng)基(配制方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[20])和5mL SWA1接種液于100mL血清瓶中,聚四氟乙烯塞子和鋁蓋密封,20mL無(wú)菌 CH4置換瓶中空氣.分別添加不同濃度的二氯乙烯(t-1,2-DCE,阿法埃莎化學(xué)有限公司,98%)、三氯乙烯(TCE,天津市科密歐化學(xué)試劑廠,色譜純)和四氯乙烯(PCE,成都市龍科化工試劑廠,分析純).實(shí)驗(yàn)組中t-1,2-DCE濃度設(shè)置為150,250,350,450,580mg/L,分別編號(hào)為 tDCE150、tDCE250、tDCE350、tDCE450和tDCE580;TCE濃度為50,100,150,200,250mg/L,分別編號(hào)為 TCE50、TCE100、TCE150、TCE200和TCE250;PCE濃度為 100,200,300,400,500mg/L,分 別編號(hào) 為PCE100、PCE200、PCE300、PCE400和PCE500.以無(wú)氯代烴樣品作為空白組,所有組分一式 2份.監(jiān)測(cè)初始生物氣和氯代烴濃度,各試樣置于30℃,170r/min的培養(yǎng)箱中,監(jiān)測(cè)微生物生長(zhǎng)曲線,生物氣濃度變化和氯代烴降解情況.

1.3 分析檢測(cè)

甲烷、氧氣和二氧化碳采用氣相色譜(川儀SC-6000A)測(cè)定,色譜條件：不銹鋼色譜柱 TDX 8-12-25 2m,進(jìn)樣口溫度、柱溫以及檢測(cè)器(TCD)溫度分別為 120,90,120℃,氮?dú)鉃檩d氣,載氣流速為 25mL/min,進(jìn)樣量為 0.5mL.氯代烯烴由SC-3000B氣相色譜儀 FID檢測(cè)器檢測(cè),GDX-104 2m 色譜柱;氮?dú)鉃檩d氣,載氣流速為35mL/min,尾吹氣速為 10mL/min;進(jìn)樣口、柱箱和檢測(cè)器溫度分別為 200,80,200℃;進(jìn)樣量為0.1mL,基流補(bǔ)償0.00nA.

1.4 DNA提取與高通量測(cè)序

分別選取空白組及不同濃度 tDCE(tDCE150、tDCE250、tDCE350、tDCE450 和tDCE580)、TCE(TCE50、TCE100、TCE150 和TCE200)和 PCE(PCE100、PCE200 和 PCE300)馴化后,生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的共13個(gè)樣品的菌液10mL,離心棄去上清液后于-80 ℃保藏用于多樣性測(cè)序分析.用購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TANamp Bacteria DNA Kit)提取樣品的基因組 DNA.樣本定量、DNA 序列修飾及驗(yàn)證和混合文庫(kù)后,將其定量稀釋至4～5pmol/L后放于Illumina MiSeq測(cè)序儀中測(cè)序(Illumina MiSeq PE250測(cè)序儀,上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司),擴(kuò)增16S rRNA基因V3～V4區(qū),引物 338F：5′-ACTCCTACGGGA-GGCAGCA-3′,引物 806R：5′-GGACTACHVG-GGTWTCTAAT-3′[20]使用合成測(cè)序法,測(cè)定長(zhǎng)度2×250bp.

過(guò)濾原始序列尾部質(zhì)量值＜20的堿基,設(shè)置50bp窗口過(guò)濾50bp以下的序列.將成對(duì)reads拼接成一條序列,最小重疊長(zhǎng)度為 10bp,且重疊區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為 0.2.最后檢測(cè)序列上的barcode并區(qū)分土樣.利用R(vegan)、CANOCO、PAST等程序軟件和NCBI、Mothur等數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)解析,對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類分析和分類學(xué)分析.

1.5 數(shù)據(jù)分析

相關(guān)性利用SPSS Statistics 21軟件分析,多樣性數(shù)據(jù)采用 i-sanger平臺(tái)(http：//www.isanger.com/)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 氯代烯烴脅迫下混合菌群的生物特性

圖1 氯代烯烴脅迫下菌體甲烷氧化活性,生長(zhǎng)特性和氯代烴降解情況Fig.1 The methane oxidation activity, growth characteristic and chloroalkene biodegradation of SWA1under chloroalkenes acclimatization

不同濃度氯代烯烴脅迫下混合菌群 SWA1的生長(zhǎng)特性,甲烷氧化能力及氯代烴降解情況如圖1所示.主要通過(guò)監(jiān)測(cè)比生長(zhǎng)速率最大時(shí)的時(shí)間(MIT)、最高菌體濃度(MD)和最大比生長(zhǎng)速率(μ)來(lái)考察SWA1的特性變化.隨著t-1,2-DCE濃度的增大(0～580mg/L),MIT緩慢增大,變化范圍為 37～73h;無(wú) t-1,2-DCE 時(shí),MD 和 μ 最大,為0.20g/L和 0.02h-1;當(dāng)添加 t-1,2-DCE濃度為150mg/L時(shí),MD和μ減小,但隨著t-1,2-DCE增大,MD 和 μ均無(wú)顯著變化,變化分別為 0.12～0.15g/L 和 0.009～0.012h-1.表明在該 t-1,2-DCE濃度范圍對(duì)SWA1的調(diào)整期具有一定的影響,隨著菌體耐受性的提高,能迅速生長(zhǎng).添加TCE(0～250mg/L)后,SWA1的 MIT 迅速增大,變化范圍為 24～142h,增長(zhǎng)近 6 倍;濃度為 0～200mg/L時(shí),SWA1的 MD無(wú)顯著變化,為 0.13～0.16g/L,μ顯著減小,為0.028～0.01h-1;當(dāng)TCE濃度增加到250mg/L時(shí),SWA1幾乎無(wú)生長(zhǎng),此時(shí)μ為0,表明最高耐受濃度約 250mg/L.添加不同濃度的 PCE(0～500mg/L)時(shí),SWA1的 MIT顯著增大,變化為 24～115h;當(dāng) PCE 濃度為 0～400mg/L時(shí),MD和μ無(wú)顯著性差異,當(dāng)增加到500mg/L時(shí)幾乎無(wú)生長(zhǎng),此時(shí)μ為0,表明對(duì)PCE最高耐受濃度為500mg/L(圖1a,b和c).

表1 氯代烯烴脅迫下甲烷氧化參數(shù)、菌群生長(zhǎng)參數(shù)及氯代烴降解參數(shù)相關(guān)性Table 1 Correlation among the methane oxidation parameters, growth parameters and chloroalkene biodegradation parameters

SWA1生長(zhǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)了甲烷消耗情況,甲烷、氧化消耗速率和二氧化碳的生成速率具有相同的變化趨勢(shì),均隨氯代烴濃度的增大減小.t-1,2-DCE濃度為0～580mg/L時(shí),甲烷氧化速率由 6.52mmol/(hgcell)減小為 2.56mmol/(hgcell);PCE濃度為0～400mg/L,甲烷氧化速率緩慢減小,當(dāng)增加至 500mg/L時(shí),無(wú)甲烷氧化;隨著 TCE濃度的增加甲烷氧化速率迅速減小,當(dāng)達(dá)到250mg/L時(shí),無(wú)甲烷氧化.根據(jù)不同氯代烴時(shí)SWA1的生長(zhǎng)特性和甲烷氧化特性變化可知對(duì)3種氯代烯烴的耐受性順序?yàn)?t-1,2-DCE＞PCE＞TCE.現(xiàn)有研究最多的為微生物對(duì) TCE耐受性,不同環(huán)境下所篩選微生物對(duì)TCE有不同耐受程度.Broholm等[15]研究了TCE對(duì)湖水沉積物分離的混合甲烷氧化菌的活性影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為13mg/L時(shí),已無(wú)甲烷氧化發(fā)生,而Choi等[13]研究發(fā)現(xiàn)濕地土壤中富集的甲烷氧化菌混合菌對(duì)TCE的最高耐受濃度為 146mg/L.對(duì)比結(jié)果表明SWA1具有更高的TCE耐受能力(圖1d,e和 f).混合菌群SWA1生長(zhǎng)到穩(wěn)定期,對(duì)3種氯代烯烴的去除率均大于 90%,SWA1在污染物降解中具有高的應(yīng)用潛力.單位時(shí)間(h-1)內(nèi)對(duì) t-1,2-DCE具有更高的降解效率,并隨著濃度的增大而緩慢減小;當(dāng)菌體活性未完全抑制時(shí),TCE和 PCE的去除效率變化很小,菌體完全抑制后無(wú)氯代烴降解(圖1g),表明混合菌群具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,已有研究發(fā)現(xiàn)混合菌群中微生物間可形成如形態(tài)變化,修改細(xì)胞屬性等多種對(duì)有機(jī)溶劑的自適應(yīng)機(jī)制[21],同時(shí)最新研究還發(fā)現(xiàn)混合菌對(duì)底物具有交替利用的現(xiàn)象[22],這對(duì)于混合菌產(chǎn)生高耐受性具有重要意義.

氯代烯烴馴化過(guò)程中各參數(shù)間相互關(guān)系如表1所示.各氯代烯烴濃度c(CAH)與甲烷氧化速率 V(CH4)(r=-0.943～-0.829,P＜0.05),氧氣消耗速率 V(O2)(r=-0.999～-0.943,P＜0.01)和二氧化碳產(chǎn)生速率 V(CO2)(r=-0.999～-0.943,P＜0.01)呈顯著負(fù)相關(guān),與 MIT呈顯著正相關(guān)(r=0.886～0.999,P＜0.05),表明高濃度氯代烯烴均抑制菌體生長(zhǎng)和生物氧化活性.V(CH4)和V(CO2)相關(guān)性結(jié)果顯著,表明二氧化碳主要來(lái)源于甲烷的生物氧化.TCE和 t-1,2-DCE共代謝降解過(guò)程中,V(CH4)與氯代烴去除效率 η呈負(fù)相關(guān),表明甲烷和氯代烴間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制關(guān)系[4].而PCE脅迫條件下,V(CH4)與PCE去除效率為正相關(guān)關(guān)系,表明SWA1對(duì)氯代烯烴存在不同的降解機(jī)制.已有研究表明低氯取代烴更易發(fā)生共代謝生物降解,全氯代烴難以發(fā)生共代謝降解[18],關(guān)于PCE的去除機(jī)理還需進(jìn)一步深入探究.

2.2 不同氯代烯烴脅迫下群落結(jié)構(gòu)豐富度、多樣性及聚類分析

圖2 Ace指數(shù)(A)及不同氯代烯烴脅迫下微生物群落結(jié)構(gòu)種間差異(B)Fig.2 Ace index (A) and difference of community structure (B) among samples under chloroalkenes acclimatization***：差異性極顯著(P＜0.001)

選取不同氯代烯烴、不同濃度馴化后混合菌樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,14個(gè)樣品共獲得 460598條16S rRNA基因片段序列.在97%的對(duì)比度下,共有1540個(gè)OTUs,覆蓋度高于99.9%,表明抽樣完全.不同氯代烯烴脅迫條件下樣品多樣性指數(shù)(Ace指數(shù))及微生物群落結(jié)構(gòu)種間差異如圖2所示. t-1,2-DCE馴化后OUT水平的Ace指數(shù)無(wú)顯著性變化,表明未顯著改變微生物多樣性.TCE和PCE脅迫下,Ace指數(shù)顯著增大,且隨TCE濃度的增大而增大,表明 TCE和 PCE顯著增大 SWA1的微生物多樣性.群落結(jié)構(gòu)種間差異結(jié)果(圖2B)顯示TCE或PCE馴化后樣品的微生物多樣性與t-1,2-DCE馴化后微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異(P＜0.01),而TCE馴化和PCE馴化后的微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著性差異,表明SWA1對(duì)不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的污染物有不同響應(yīng).

不同氯代烴耐受條件下樣品在各分類水平下的層級(jí)聚類和PCA分析如圖3所示.不同分類水平下的層級(jí)聚類圖和PCA圖差別較大.門水平層級(jí)聚類和 PCA 分析結(jié)果(圖3A和 a)顯示SWA1在門水平的群落組成不受氯代烴種類和濃度的影響,表明SWA1門水平微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.綱水平層級(jí)聚類和PCA(圖3B和b)結(jié)果表明該水平微生物群落結(jié)構(gòu)在同一氯代烴馴化后具有相似性;屬水平層級(jí)聚類和PCA(圖3C和c)結(jié)果顯示,同一氯代烴馴化后,微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性相似度最大,表明不同氯代烯烴對(duì)SWA1屬組成和相對(duì)豐度有顯著影響.TCE和PCE耐受性馴化后 SWA1的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度大,表明TCE和PCE對(duì)微生物的影響機(jī)理更相似.

圖3 氯代烯烴脅迫下不同分類水平下的層級(jí)聚類和PCA分析Fig. 3 Hierarchical clustering and PCA analysis of different level of classification under different chloroalkenes acclimatization

2.3 組間微生物群落結(jié)構(gòu)組成及菌屬差異

高通量測(cè)序技術(shù)分析不同氯代烯烴脅迫下SWA1群落結(jié)構(gòu)組成.所有樣品中變形菌門Proteobacteria和擬桿菌門bacteroidetes為主導(dǎo)菌門,相對(duì)豐度大于98%,而變形菌門Proteobacteria相對(duì)豐度大于85%.不同濃度不同氯代烯烴馴化樣品中變形菌門 Proteobacteria和擬桿菌門 bacteroidetes相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異(P=0.45～0.52),表明 SWA1中大多數(shù)功能微生物均屬于這兩門.已有對(duì)覆蓋土微生物群落結(jié)構(gòu)的研究表明對(duì)覆蓋土的多樣性測(cè)序表明變形菌門 Proteobacteria、厚壁菌門 Firmicutes和擬桿菌門Bacteroidetes為主導(dǎo)菌門[23].

圖4 不同氯代烴馴化后微生物群落結(jié)構(gòu)(A)和多物種差異檢驗(yàn)(B)Fig.4 Column charts of Microbial community structure (A) and diversity test of different species after chloroalkenes acclimatization (B)

不同氯代烯烴脅迫下 SWA1屬水平群落組成及優(yōu)勢(shì)菌屬差異性如圖4所示.t-1,2-DCE脅迫下 SWA1中優(yōu)勢(shì)菌屬為甲基單胞菌屬M(fèi)ethylomonas(31.7%～62.2%)、 嗜 甲 基 菌 屬M(fèi)ethylophilus(17.4%～26.6%)、甲基孢囊菌屬(未分類)Methylocystaceae_Unclassified(2.9%～13.3%)和 Sediminibacterium(1.4%～9.5%).TCE脅迫下SWA1優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜甲基菌屬 Methylophilus(26.9%～46.3%)、甲基孢囊菌屬(未培養(yǎng))Methylocystaceae_uncultured(8.1%～25.1%)、甲基八疊球菌屬 Methylosarcina(3.8%～23.2%)和甲基孢囊菌屬(未分類)Methylocystaceae_Unclassified(1.3%～21.8%).PCE脅迫下優(yōu)勢(shì)菌屬為嗜甲基菌屬 Methylophilus(37.9%～61.7%)、甲基孢囊菌屬(未培養(yǎng))Methylocystaceae_uncultured(1.7%～33.4%),甲 基 單 胞 菌 屬M(fèi)ethylomonas(0.4%～16.6%)和 Ferruginibacter(3.4%～5.3%)(圖4A).表明不同氯代烯烴脅迫下,SWA1中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化.Choi等[13]研究TCE和PCE對(duì)濕地土壤分離的混合甲烷氧化菌的影響,分析了其中甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)組成及變化,發(fā)現(xiàn)甲基孢囊菌屬 Methylocystis為優(yōu)勢(shì)菌屬,對(duì) TCE和PCE具有高耐受性.Shukla等[24]研究了由水稻田分離的混合甲烷氧化菌對(duì)TCE的降解,證明混合菌種Methylocystis對(duì)TCE降解起重要作用.而本研究中利用填埋場(chǎng)分離的混合菌在TCE和PCE脅迫下,Methylophilus在混合菌群相對(duì)豐度最大,對(duì)TCE和PCE具有高的耐受性,表明不同污染場(chǎng)地的微生物結(jié)構(gòu)和功能具有很大差異.

不同氯代烯烴脅迫下,物種差異性分析結(jié)果如圖4B所示.Methylophilus(P=0.044)、Methylomonas(P=0.015)、Methylocystaceae_Uncultured (P=0.010)、Methylosarcina(P=0.021)、Methylococcaceae_Unclassified (P=0.012)、嗜酸菌屬 Acidovorax(P=0.025)、鞘氨醇單胞菌 Sphingomonas(P=0.010)、不動(dòng)桿菌屬 Acinetobacter(P=0.034)和 Hydrotalea(P=0.032)差異性顯著,t-1,2-DCE脅迫下 Methylomonas的相對(duì)豐度最大,表明Methylomonas對(duì) t-1,2-DCE有高的耐受性,在t-1,2-DCE的生物降解中起重要作用,已有關(guān)于Methylomonas methanica NCIB1113降解 t-1,2-DCE的報(bào)道[25].

2.4 混合菌群微生物在生物降解中的可能作用分析

氯代烴脅迫條件下生物降解參數(shù)與微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性如表2所示.隨t-1,2-DCE濃度的增大,金黃桿菌屬 Chryseobacterium、Sediminibacterium和Methylomonas的相對(duì)豐度增加,該類菌株可耐受高濃度 t-1,2-DCE.甲烷氧化菌菌屬M(fèi)ethylocystaceae_Unclassified、甲基球目菌屬(未分類)Methylococcales_Unclassified、Methylophilus和非甲烷氧化菌菌屬Ramlibacter、Acidovorax與 V(CH4)呈顯著正相關(guān)(r=0.89～0.99,P＜0.05),表明在t-1,2-DCE脅迫條件下這些菌屬是SWA1中對(duì)甲烷氧化起重要作用.在混合菌屬中,非甲烷氧化菌Ramlibacter和Acidovorax一方面可能通過(guò)與甲烷氧化菌的協(xié)同作用關(guān)系促進(jìn)甲烷氧化,另一方面可能直接參與甲烷代謝,有研究顯示 Acidovorax在甲烷產(chǎn)生環(huán)境中具有高的相對(duì)豐度[26-27],關(guān)于這些非甲烷氧化菌在甲烷消耗中的作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證.SWA1中只有Methylomonas(r=0.486)和Sediminibacterium (r=0.657)相對(duì)豐度與t-1,2-DCE降解效率η呈正相關(guān),表明它們對(duì)t-1,2-DCE的降解起主要作用,已有研究證明含有Methylomonas的混合菌或分離的純菌株 Methylomonas都能通過(guò)共代謝降解t-1,2-DCE等氯代烴[28-29].未見(jiàn) Sediminibacterium降解氯代烴的報(bào)道,有研究表明Sediminibacterium在混合菌中可產(chǎn)生葡萄糖等化合物[30],因此Sediminibacterium可通過(guò)為其他微生物提供生長(zhǎng)底物的協(xié)同作用方式促進(jìn)氯代烴降解.純種菌株共代謝降解氯代烴研究中發(fā)現(xiàn)氯代烴去除和甲烷氧化間存在不可避免的競(jìng)爭(zhēng)性抑制[31-32],相關(guān)性結(jié)果顯示SWA1中與甲烷氧化和 t-1,2-DCE去除相關(guān)菌屬不盡相同(表4),這在一定程度上可緩解競(jìng)爭(zhēng)性抑制的發(fā)生,更有利于氯代烴的去除.

TCE脅迫條件下,菌屬 Methylocystaceae_Unclassified、Methylocystaceae_uncultured、Ramlibacter、Methylosarcina、Sphingomonas、Sediminibacterium和Acidovorax與TCE濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.50～0.90),表明這些菌屬耐高濃度TCE.SWA1中甲烷氧化菌菌屬M(fèi)ethylophilus、Methylomonas及非甲烷氧化菌菌屬Cloacibacterium 對(duì)甲烷氧化起主要作用,有研究顯示 Cloacibacterium為水環(huán)境沉積物和市政廢水中的主要微生物[33-34],表明其在有機(jī)物降解中起重要作用.高耐受TCE微生物均與η呈正相關(guān)關(guān) 系,菌 屬 Methylocystaceae_uncultured、Ramlibacter、Methylosarcina、Sediminibacterium和Acidovorax對(duì)TCE的去除起主要作用,甲烷氧化菌在TCE降解研究中已有許多報(bào)道[5],也有研究證明Acidovorax對(duì)地下水中TCE去除起重要作用[35],可知SWA1對(duì)于氯代烴的去除并非只有甲烷為底物的共代謝降解過(guò)程.同樣,該條件下,甲烷氧化微生物和氯代烴降解微生物主要菌屬不盡相同,生物降解過(guò)程中混合菌屬SWA1中各菌株既有協(xié)同作用關(guān)系又相互獨(dú)立.

PCE脅迫下,根據(jù)微生物群落結(jié)構(gòu)變化,可知甲烷氧化相關(guān)微生物為 Methylophilus.Methylocystaceae_uncultured在高濃度PCE環(huán)境中具有高的相對(duì)豐度,表明其對(duì)PCE具有高的耐受性.在優(yōu)勢(shì)菌屬中 Acidovorax有報(bào)道可進(jìn)行PCE的生物降解.不同氯代烯烴脅迫條件下,SWA1群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異,甲烷氧化微生物和氯代烴降解微生物均不盡相同,說(shuō)明群落結(jié)構(gòu)改變是SWA1功能變化的重要原因.

表2 氯代烴脅迫下降解參數(shù)與微生物相關(guān)性Table 2 Correlation between relative abundances of the microbial diversity at dominant bacterial taxa and SWA1characteristics

2.5 氯代烯烴降解過(guò)程微生物的可能相互作用分析

自然環(huán)境中,污染物的有效去除依賴于混合菌中多種微生物的協(xié)同作用關(guān)系[9-10].基于Spearman相關(guān)性系數(shù),建立種群中不同菌屬間的相互作用關(guān)系網(wǎng),獲得物種在環(huán)境樣本中的共存關(guān)系,t-1,2-DCE和TCE脅迫下SWA1中優(yōu)勢(shì)菌屬相互作用關(guān)系網(wǎng)如圖5所示.SWA1中絕大多數(shù)優(yōu)勢(shì)菌屬間為正相關(guān),表明在生物降解過(guò)程中,協(xié)同作用是各菌屬間的主要關(guān)系.不同甲烷氧化菌間,不同非甲烷氧化菌間及甲烷氧化菌和非甲烷氧化菌間均存在相互作用關(guān)系,各菌屬間既有直接作用又有間接相互作用.t-1,2-DCE脅迫條件 下 Methylophilus、 Methylococcales_Unclassified、Methylocystaceae_Unclassified和Cloacibacterium各菌屬間均存在正相關(guān)關(guān)系.TCE脅迫條件下,Ramlibacter黃單胞菌(未分類)Xanthomonadaceae_unclassified、Methylosarcina、Acidovorax和Sediminibacterium菌屬間存在正相關(guān)關(guān)系.根據(jù)甲烷氧化菌代謝特性,二氧化碳產(chǎn)生速率為甲烷氧化速率的一半[36],該反應(yīng)體系中,唯一生長(zhǎng)底物為甲烷,共代謝底物為氯代烴,監(jiān)測(cè)過(guò)程發(fā)現(xiàn)二氧化碳增加速率與甲烷消耗速率幾乎相等,而所添加氯代烴中所含的當(dāng)量二氧化碳遠(yuǎn)小于甲烷中的當(dāng)量二氧化碳,這表明近一半的二氧化碳來(lái)源于非甲烷氧化菌的新陳代謝,生長(zhǎng)底物來(lái)源于甲烷氧化菌代謝的有機(jī)物.已有相關(guān)研究表明甲烷氧化菌與非甲烷氧化菌相互作用關(guān)系可以為混合菌提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境和合適的基質(zhì)組成[37-38].

圖5 不同氯代烯烴脅迫下微生物間的相互作用關(guān)系網(wǎng)Fig.5 The interaction networks of the microorganism in SWA1under different chloroalkenes acclimatization

3 結(jié)論

3.1 混合菌 SWA1對(duì)氯代烯烴有高的耐受性,對(duì)t-1,2-DCE的最高耐受濃度高于580mg/L;對(duì)TCE最高耐受濃度為250mg/L;對(duì)PCE最高耐受濃度為500mg/L.好氧共代謝條件下SWA1能有效降解氯代烴,對(duì)t-1,2-DCE去除率高于90%.3.2 不同氯代烯烴脅迫條件下,混合菌SWA1微生物群落結(jié)構(gòu)種間差異顯著,t-1,2-DCE馴化后優(yōu)勢(shì)菌屬為 Methylomonas(31.7%～62.2%),TCE和PCE馴化后優(yōu)勢(shì)菌屬為Methylophilus(26.9%～46.3%,37.9%～61.7%).

3.3 氯代烯烴共代謝降解過(guò)程中,直接參與甲烷氧化和氯代烴降解微生物差異較大,t-1,2-DCE 共代謝生物降解中 Methylophilus、Ramlibacter和 Acidovora促進(jìn)甲烷氧化,Methylomonas參與t-1,2-DCE降解.TCE共代謝降解中參與甲烷氧化和氯代烴降解的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為 Methylophilus和 Cloacibacterium.Methylocystaceae_uncultured對(duì)TCE降解起重要作用.

3.4 微生物spearman相關(guān)性分析顯示SWA1中t-1,2-DCE 脅 迫 條 件 下 Methylophilus、Methylococcales_Unclassified、Methylocystaceae_Unclassified和Cloacibacterium各菌屬間均存在直接正相關(guān)關(guān)系.TCE脅迫條件下,Ramlibacter、Xanthomonadaceae_unclassified、Methylosarcina、Acidovorax和Sediminibacterium菌屬間存在直接正相關(guān)關(guān)系.菌屬間相互協(xié)同作用強(qiáng)化SWA1生物活性.

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