東港市豬主要寄生蟲病流行情況調(diào)查

邱吉源

（東港市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，遼寧東港 118300）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料來源

取自東港市某豬場仔豬拉稀糞便。病豬的中后段空腸有卡他性或局灶性、偽膜性炎癥，空腸和回腸黏膜表面有斑點(diǎn)狀出血和纖維素性壞死斑塊，腸系膜淋巴結(jié)水腫性增大。顯微鏡下觀察可見腸絨毛的萎縮、融合，腸隱窩增生、濾泡增生和壞死性腸炎，腸上皮細(xì)胞灶性壞死，在絨毛頂端有纖維素性壞死物，并可在上皮細(xì)胞內(nèi)見到大量成熟的裂殖體、裂殖子等內(nèi)生性階段蟲體。

1.1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) Genbank 上的 Isospora suis 18SrRNA 基因全序列（U97523）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擬擴(kuò)增產(chǎn)物 1178bp。上游引物 5-ACCCACCTTCTGGTGGTCCTCAGGT-3；下游引物 5-CACGCAAAGTCCTCTAAGAAGTGATA-3。

1.1.3 主要試劑和器材

UNIQ-10 柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒。上海生物工程有限公司，Taq 酶 Takara 公司（大連），PMD18-T Uector Takara 公司（大連），膠回收試劑盒杭州博日科技有限公司，DL2000 Marker BBI公司（美國），移液槍 Eppendorf 公司（德國），生物安全柜 蘇凈集團(tuán)安泰公司，UNO II PCR 儀 Biometra 公司（德國），DYY 8C 電泳儀北京六一儀器廠，MiniBis Pro 凝膠成像系統(tǒng)DNR公司（以色列），Percellys 24 多功能樣品均質(zhì)器 Benin Technologies 公司（法國）。

1.2 方法

1.2.1 豬等孢球蟲卵囊的收集

取鏡檢卵囊較多的仔豬糞便 10g 于自來水中混勻，用 60 目糞篩過濾，3000r/10min，棄上清液，沉淀于飽和鹽水中漂浮 30min左右，吸取上層液置 2.5%重鉻酸鉀溶液中。

1.2.2 豬等孢球蟲卵囊的純化

將收集的濾液 3000r/min，離心 10min，棄上清液，加入 10 倍體積清水混勻后3000r/min，再離心 10min。洗滌 3 次后加入 5 倍體積飽和食鹽水 3000r/min，離心 10min。表面漂浮的白色物質(zhì)即是卵囊。經(jīng)過孢子化檢查發(fā)現(xiàn)，大部分孢子化卵囊為 4 個(gè)子孢子，內(nèi)含 2 個(gè)孢子囊的豬等孢球蟲。少數(shù)卵囊為 2 個(gè)子孢子，內(nèi)含 4個(gè)孢子囊的豬艾美爾球蟲。

1.2.3 豬等孢球蟲卵囊 DNA 的提取

取研磨好的樣品 200μl，加入 200μlDigestion Buffer，混勻；加入 20μlProteinaseK，混勻，55℃保溫 30min。加入 200μlBD Buffer，70°C 溫育 10min。加入 200μl無水乙醇，混勻。然后加入 UNIQ-10 柱。10000r/min，離心 1min.丟棄廢液。加入500μL PW Solution，10000r/min，室溫離心 1min。丟棄廢液。加入 500μl Wash Solution，10000r/min，室溫離心 1min。丟棄廢液。室溫離心 1min。加入新的 1.5ml 離心管。在柱子中央加入 50μl 60℃預(yù)熱的 Elution Buffer，放置 5min。10000r/min。提取好的DNA 放于-20℃ 冰箱保存。

1.2.4 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用本引物，對(duì)豬球蟲 DNA、弓形蟲 DNA、大腸桿菌 DNA及附紅細(xì)胞體DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證該引物的特異性。

1.2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

將豬等孢球蟲進(jìn)行麥克馬斯特計(jì)數(shù)，計(jì)算得豬等孢球蟲卵囊為 2×104個(gè) /ml。將卵囊稀釋為 2×104個(gè) /ml，1×104個(gè) /ml，8×103個(gè) /ml，5×103個(gè) /ml，2×103個(gè) /ml。

1.2.6 臨床樣本檢查

應(yīng)用本引物，對(duì)鏡檢蟲卵較多的仔豬糞便進(jìn)行卵囊純化，然后提取 DNA 進(jìn)行 PCR 檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將豬球蟲提取基因組DNA后用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，其大小約1200bp，與預(yù)期一致。

2.2 測序結(jié)果分析

上述 PCR 產(chǎn)物經(jīng)上海生工測序，應(yīng)用 DNAstar 軟件，與NCBI 收集的豬球蟲序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)序列同源性為 99.7%。經(jīng) DNAstar 進(jìn)行序列分析可以看出 11 種原蟲處于 2 個(gè)進(jìn)化枝上。其中測序株，isospora suis、sp.Harbin、ohioensis、orlovi、belli、felis、toxoplasma gondi在第一枝，eimeria porci、scalcra、polita 位于第二枝。第一枝中，同源性都達(dá)到97%以上，其中 ohioensis、orlovi、sp.Harbin 與測序株同源性高達(dá) 99%以上，與下載序列（U97523）isospora suis 同源性高達(dá) 99.7%，說明所擴(kuò)增序列達(dá)到預(yù)期要求，該測序株為豬等孢球蟲。與第二枝上的艾美爾球蟲同源性差距較大，說明等孢球蟲和艾美爾球蟲同源性較低。

2.3 特異性試驗(yàn)

將提取的豬球蟲 DNA 和已知的弓形蟲 DNA、大腸桿菌DNA、附紅細(xì)胞體DNA 用合成的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，只有豬球蟲 DNA 樣品有 1200bp 條帶。其他均無條帶。

2.4 敏感性試驗(yàn)

經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增，顯示該方法最低可以檢測豬等孢球蟲卵囊數(shù)量為5×103個(gè)/ml。

2.5 臨床檢測

取 10 份仔豬糞便進(jìn)行鏡檢和 PCR 擴(kuò)增，其中陽性糞便均擴(kuò)增出約 1200bp大小條帶。

3 討論

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖方式發(fā)生變化，由過去的散養(yǎng)變?yōu)楝F(xiàn)在的集約化養(yǎng)殖，豬球蟲的感染率變高，尤其以等孢球蟲的危害更為嚴(yán)重。等孢球蟲多見于仔豬，可引起仔豬腹瀉，體重變輕，嚴(yán)重的甚至引起仔豬糞便帶血。

目前國內(nèi)外對(duì)等孢球蟲 PCR 研究做的比較少，其中 Johanna Johnson等用 PCR 方法檢測豬等孢球蟲，B.Ruttkowski等用 PCR方法鑒定艾美爾球蟲和豬等孢球蟲，我國劉長輝等（2007）建立豬等孢球蟲 PCR 診斷方法，姚雷等（2007）建立豬等孢球蟲巢式PCR 診斷方法。為本次試驗(yàn)提供了研究方向。

豬糞便中雜質(zhì)較多，而且有時(shí)會(huì)出現(xiàn)艾美爾球蟲和等孢球蟲混合感染的情況。對(duì)于豬等孢球蟲的鑒定需要經(jīng)過 4 天孢子化才能確定，需要的時(shí)間較長應(yīng)用本法可以準(zhǔn)確判斷是否感染豬等孢球蟲。該 PCR 檢測方法對(duì)豬等孢球蟲孢子化卵囊和未孢子化卵囊均能擴(kuò)增出特異性條帶，說明可以直接選擇新鮮糞便進(jìn)行 PCR 檢測，無需進(jìn)行孢子化，縮短了檢測時(shí)間。特異性試驗(yàn)表明，該實(shí)驗(yàn)對(duì)于其他相關(guān)蟲體均無交叉反應(yīng)，說明具有較高的特異性。因?yàn)?PCR 方法需要的儀器和試劑費(fèi)用較高，所以該方法應(yīng)該作為輔助檢測而不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的顯微鏡檢查。

4 結(jié)論

通過這次調(diào)查發(fā)現(xiàn)：豬胃腸道寄生蟲調(diào)查的 1087 份樣品，其中豬蛔蟲陽性樣品 49 份，陽性率為 4.51%。豬結(jié)節(jié)蟲陽性樣品13 份，陽性率為 1.19%，豬類圓線蟲陽性樣品為 29 份，陽性率為 2.67%，豬鞭蟲陽性樣品 17 份，陽性率為1.56%。豬球蟲陽性樣品為 209 份，感染率為 19.23%，豬結(jié)腸小袋纖毛蟲陽性樣品為341 份，感染率為 31.37%。

根據(jù) Genbank 上的 Isospora suis 18SrRNA 基因全序列（U97523）設(shè)計(jì) 1對(duì)特異性引物，建立豬等孢球蟲病的 PCR 診斷方法并進(jìn)行了敏感性和特異性實(shí)驗(yàn)。此方法可以快速診斷豬等孢球蟲的感染，縮短了孢子化的時(shí)間，極大的提高了檢測效率。